POLYMERASE CHAIN

REACTION (PCR)
DEFINISI DNA
(DEOXYRIBONUCLEIC ACID)
materi genetik yang terdapat di
dalam inti sel makhluk hidup. Materi
itu berbentuk seperti tangga. Bukan
tangga yang lurus, tetapi tangga yang
berpilin.
DEFINISI POLYMERASE CHAIN REACTION
(PCR)
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk
mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR
dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan
jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa
nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali
jumlahnya. Kunci utama pengembangan PCR adalah
menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan
DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-
target.B
 PRINSIP KERJA PCR
Menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh
untaian DNA, baik yang berasal dari DNA sel inti
(nukleus) maupun organel sel seperti DNA
mitokondria (mtDNA) atau Ribosom (rDNA). Untuk
mendapat potongan DNA, diperlukan Primer yang
berfungsi untuk menandai dimana ujung DNA yang
akan digandakan. Primer biasanya berpasangan, yaitu
Primer forward untuk menandai ujung depan untai
DNA dan Primer Reverse untuk menandai dari ujung
belakang. Karena DNA terdiri dari 2 untai pilinan
ganda (double strand), maka DNA Primer forward
bekerja pada strand yang satu sementara Primer
Reverse bekerja pada untai pilihan yang satunya.
 TAHAPAN-TAHAPAN POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR) :

1. Denaturasi DNA untai ganda akan membuka

menjadi dua untai tunggal.

2. Penempelan primer primer akan menuju daerah

yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer.

3. Reaksi polimerisasi (Extension) Primer yang

telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan
pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang
komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.
 SELAIN KETIGA PROSES TERSEBUT, PCR
DIDAHULUI DAN DIAKHIRI OLEH TAHAPAN BERIKUT

Pra-denaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk

memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi
DNA Polymerase

Final elongasi

Dilakukan pada suhu optimum enzim (70oC -72oC) selama 5-

15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang
tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini
dilakukan setelah siklus PCR terakhir.
 REAGEN KHUSUS YANG DIBUTUHKAN
DALAM PCR

Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit

urutan yang akan diamplifikasi
Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3,
7,5 mM MgCl2)
Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP,
dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM (ultra murni
DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran
dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-
masing empat dNTP terpisah yang digabung.
LANJUTAN. . . .

Minyak mineral ringan

Akrilamida (grade elektroforesis)

N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis,

Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)

Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)

TEMED (N, N, NN Tetramethylethylenediamine,

Ultra-Murni / BRL, # 5524UB).

Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-

Elmer/Cetus)
 PERALATAN KHUSUS YANG YANG DIBUTUHKAN DALAM
PELAKSANAAN PCR ANTARA LAIN

Mighty-small II SE-250 vertical gel

electrophoresis unit (Hoefer)

Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler

Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge

tubes: (TC-5, Midwest Scientific)
WAKTU YANG DIBUTUHKAN ANTARA LAIN
ADALAH :
1-2 hari

PCR: 3-6 jam atau semalam

Polyacrylamide gel electrophoresis using Mighty-small

II gel apparatus: 2.5 hours poliakrilamid gel
elektroforesis menggunakan Mighty-small II bahan
gel: 2,5 jam

Etidium bromide staining dan fotografi: 45 menit

KOMPONEN-KOMPONEN POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR)

1. Enzim DNA polymerase

2. Primer

3. Reagen lainnya
VARIASI DARI POLYMERASE CHAIN REACTION
(PCR)
1. Alel-spesifik PCR atau kloning teknik diagnostik
2. Polymerase Cycling Assembly (PCA)
3. Asymmetric PCR
4. Amplifikasi tergantung helikase
5. Hot Start PCR
6. PCR spesifik Intersequence (ISSR)
7. Inverse PCR
8. Mediated PCR Ligasi
9. PCR spesifik Metilasi (MSP)
LANJUTAN. . . .
10. Miniprimer PCR
11. Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA)
12. Multiplex-PCR
13. Nested PCR
14. Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan
tumpang tindih ekstensi (BUMN)
15. Kuantitatif PCR (Q-PCR)
16. RT reverse transcription PCR (RT-PCR)
17. PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR )
18. Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR)
MACAM-MACAM POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR)
Real-Time PCR (Quantitative Real time
Polymerase Chain Reaction atau Q-PCR).

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR)

Nested PCR

PCR-ELISA
MANFAAT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Amplifikasi urutan nukleotida.

Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu

DNA yang mengalami mutasi.

Bidang kedokteran forensik.

Melacak asal-usul sesorang dengan

membandingkan finger print.
SAAT INI PCR SUDAH DIGUNAKAN SECARA LUAS UNTUK
BERBAGAI MACAM KEBUTUHAN, DIANTARANYA

Isolasi Gen.

DNA Sequencing.

Identifikasi Forensik.

Diagnosa Penyakit.
NAMA KELOMPOK 9 :

1. Eka Yulianti

2. Annisa Luthfi Lathifah

3. Angga Ardiantus

4. Maria Crispyanti