BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ENZIMOLOGIA Y BIOCATALISIS

Profesor Dr. Pedro Pelez Snchez

http://pedro-pelaez.blogspot.pe/
pedro.pelaez@unas.edu.pe
2017
 INTRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA
1. Introduccin
2. Historia de la Enzimologa
3. Descripcin general de las enzimas
4. Factores que afectan la actividad enzimtica
5. Actividad enzimtica
6. Cintica enzimtica
7. Nomenclatura - Clasificacin
1. INTRODUCCIN

* La vida depende de una serie de reacciones

qumicas perfectamente organizadas. Sin
embargo, muchas de estas reacciones, por s
mismas, tienen lugar a una velocidad demasiado
lenta como para dar respuesta a los diversos
procesos vitales
 HISTORIA ENZIMAS

Catlise biolgica incio siglo XIX

digestin de carne: estomago;
digestin de almidn: saliva.
Dcada de 50
Louis Pasteur - concluiu que a fermentao do acar em
lcool pela levedura era catalisada por fermentos = enzimas.
Eduard Buchner (1897)
extratos de levedo podiam fermentar o acar at lcool;
enzimas funcionavam mesmo quando removidas da clula
viva.

5
 HISTORIA ENZIMAS
James Sumner (1926)
Isolou e cristalizou a urease;
Cristais eram de protenas;
Postulou que todas as enzimas so protenas.

John Northrop (dcada 30)

Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas;

Dcada de 50 sc. XX
75 enzimas isoladas e cristalizadas;
Ficou evidenciado carter protico.

Atualmente + 2000 enzimas so conhecidas.

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 ENZIMAS PROTENA

Classificao protenas

Protenas globulares Protenas fibrosas

Estrutura das protenas

Primaria Secundaria Terciria Quaternria

ENZIMAS
Protenas com alto peso
Protenas globulares molecular, maioria entre 15 a
1000 Kilo Daltons Unit (KD)
OBS: 1 Dalton = 1 unidade de
peso molecular (AMU)
Estrutura terciria
7
 ENZIMAS ESTRUTURA

Estrutura Holoenzima
Enzimtica

Protena Cofator

Ribozimas
Apoenzima ou Pode ser:
Apoprotena on inorgnico
molcula orgnica
RNA
Coenzima
Se covalente
Grupo Prosttico
8
 La Naturaleza ha diseado los catalizadores biolgicos,
o biocatalizadores.

* Los biocatalizadores pueden

ser de:
- naturaleza proteica:
enzimas (protena),
abzymas (anticuerpos catalticos),
- naturaleza no-proteica:
ribozimas (RNAs catalticos)
* De todos ellos, los ms abundantes son las
enzimas.
* Estos biocatalizadores son capaces de acelerar la
velocidad de reaccin, varios rdenes de magnitud,

104 1018.
 -Veamos algunos ejemplos:
Velocidad Velocidad
sin enzima con enzima
CO2 + H2O HCO3- + H+ 1 107
(Anhidrasa carbnica)

H2O2 H2O + O2 1 109

(Catalasa)
12
G-1-P G-6-P 1 10
(Fosfoglucomutasa)
14
Urea + 2H2O NH4 + 2CO2+
1 10
(Ureasa)

* Este poder cataltico de las enzimas es el que hace

posible que los diferentes procesos vitales, en todas
las formas de vida -desde los virus al hombre-,
tengan lugar de manera eficiente.
 Cules son las propiedades especiales de las enzimas que
las hacen catalizadores tan eficientes?

-La respuesta a esta pregunta no es fcil:

* Este es uno de los aspectos, ms importantes, de la

Enzimologa que intentaremos estudiar a lo largo del curso.

* E intentaremos, siempre cuando sea posible, justificarla a

nivel molecular.

Pero antes, comencemos fijando ciertas ideas, a nivel formal,

tales como definiciones, smbolos, nomenclaturas, etc.
Las enzimas como catalizadores biolgicos

Las enzimas son protenas, producidas por los seres vivos

que tienen capacidad para catalizar con gran eficiencia
procesos muy especficos.
* Los seres vivos tienen enzimas multitud de Enzimas
diferentes
Ej. Escherichia coli 4288 protenas
2658 (62%) Caracterizadas
1701 (64%) Enzimas
 Eucariotas todava es superior

Naturaleza proteica de las enzimas, apunta a las cuestiones

bsicas de la Enzimologa:

- Mecanismo cataltico,
- Especificidad.
- Regulacin
Definicin de catalizador
* Un catalizador es una sustancia que aumenta la velocidad de una
reaccin, sin verse alterada en el proceso global.
* La mayor parte de los catalizadores biolgicos (aunque no
todos ellos) son enzimas.
* La sustancia sobre la que acta una enzima se
denomina sustrato de esa enzima.

-Veamos todo esto en un

ejemplo:
H2O2 ------- H2O + O2
* Esta reaccin, aunque fuertemente favorecida
termodinmicamente, es muy lenta, a menos
que sea catalizada.
 Velocidad de Reaccin
Sin catalizador 1 100
Con catalizador qumico (FeCl3) 1.000 103
En presencia de Hb 1.000.000 106
En presencia de catalasa 1.000.000.000 109

* Este ejemplo nos muestra que la velocidad de una reaccin

termodinmicamente favorable depende en gran medida de que exista o
no un catalizador y de la naturaleza del mismo.

* Los catalizadores biolgicos, entre ellos las enzimas,

se encuentran entre los ms eficaces y especficos que se
conocen.
* En este punto, nos conviene resaltar dos hechos importantes:

1. Un catalizador verdadero, aunque participa en el proceso

de reaccin, no se modifica a lo largo de ella.
2. Los catalizadores modifican la velocidad de los procesos,
pero no afectan la posicin de equilibrio de una
reaccin.

Ya que en el equilibrio:

V1 = V2
 Factores
Fatores que Alteram a Atividade
de Enzimas
Cintica Enzimtica
Michaeliana
No-Michaeliana
 Importncia Biomdica
Princpio Fundamental da Homeostase
estabelece que
Sade Normal

Composio do meio interno deve ser mantida dentro

de limites relativamente estreitos

Centenas de reaes enzimticas

Velocidades das reaes sejam apropriadas

AlteraesPerturbaes no equilbrio homeosttico

 Importncia Biomdica

Fatores que alteram a velocidade de

reaes enzimticas:
concentrao das enzimas
concentrao dos substratos
temperatura
pH
presena de inibidores
 Introduo Cintica
Enzimtica
Estudo da velocidade da reao (V): S P

Quantidade de produto formado

V
Quantidade de substrato transformado

(em unidade de tempo)

Atividade enzimtica pode ser medida pela

velocidade da reao catalisada
 Fatores que alteram a atividade
de uma enzima
E + S ES E+P

Fatores decorrentes da natureza protica das enzimas

- pH
- temperatura
Fatores decorrentes da formao do complexo ES
- concentrao do substrato
- concentrao da enzima
Presena de inibidores
 Influncia do pH do meio sobre a
atividade enzimtica
Mantidas fixas as condies de
-temperatura
-concentrao de substrato
-concentrao de enzima

pH timo pH
 Influncia do pH do meio sobre a
atividade enzimtica
pH timo varia para
diferentes enzimas

a) fosfatase cida
resduo de aa envolvido na catlise
aspartato - pH timo 4,5

b) fosfatase alcalina
resduo de aa envolvido na catlise
lisina - pH timo 9,5
 Influncia do pH do meio sobre a
atividade enzimtica
FOSFATASES
RO-PO3-2 + H2O RO-H + HO- PO3-2
Fosfatase alcalina (pH timo ~9,5)
Presente em vrios tecidos
Fgado - na concentrao na doena heptica obstrutiva
Osso - papel provvel na deposio de fosfato de clcio
na concentrao em distrbios sseos
Invaso do osso por cncer de um tumor primrio - metstase
fisiolgico durante a adolescncia - crescimento sseo

Fosfatase cida (pH timo ~4,5)

Enzima lisossmica
Carcinoma metastsico de prstata libera quantidades
desta enzima no sangue
 Influncia da temperatura do meio
sobre a atividade enzimtica
Mantidas fixas as condies de
-pH timo Temperatura tima
-concentrao de substrato
-concentrao de enzima

Ativao
trmica Desnaturao
trmica
 Influncia da concentrao da enzima
sobre a atividade enzimtica

Mantidas fixas as condies de

- temperatura tima
- pH timo
- [substrato] em excesso

[E]
 Influncia da concentrao de substrato
sobre a atividade enzimtica
Mantidas fixas as condies de
- temperatura tima
- pH timo
- [enzima]

Cintica de
ordem zero

Cintica de
1a ordem

[S]
 Influncia da concentrao de substrato
sobre a atividade enzimtica
Baixa concentrao de substrato

E E S
S + E E E E
P
E E E E E E
+
P

Formao do produto PROPORCIONAL

concentrao de substrato
Influncia da concentrao de substrato
sobre a atividade enzimtica
3/4 de saturao do centro ativo da enzima

S S S P
E E E E E E P
S + + P
E E E E E E P
S S P
P

Formao do produto PROPORCIONAL

concentrao de substrato
 Influncia da concentrao de substrato
sobre a atividade enzimtica

100 % de saturao do centro ativo da enzima

S S S P P
E E E E E E
S P
+ E E + P
S E E E E
S S P P
S
P
P

Formao do produto PROPORCIONAL

concentrao de substrato
 Influncia da concentrao de substrato
sobre a atividade enzimtica
[Substrato] em excesso

S
S S
E E S S E E P P
S S + E E
S E E E E E E + P P
S S S S P P
P
S S P
S S
S S
S
Velocidade da reao independe da [S] S
Influncia da concentrao de substrato
sobre a atividade enzimtica
Quando a
formao de P for
proporcional [S] Quando a velocidade
a velocidade da da reao independe
reao de da [S] a reao de
1a ORDEM ORDEM ZERO

[S]
 Actividad Enzimtica
Depende tambm:
presena e concentrao do cofator
poder cataltico da enzima
capacidade da enzima de transformar o substrato ligado ao
complexo ES em produto por unidade de tempo
ES E + P
afinidade da enzima pelo substrato (Km)
maior ou menor capacidade da enzima de se ligar ao
substrato
E + S ES
 Enzimas Poder cataltico
Capacidade de converter substrato em
produto em unidade de tempo
QUIMIOTRIPSINA - 1,9 x 102 mis/s
ANIDRASE CARBNICA - 1 x 106mis/s

NMERO DE RENOVAO
(TURNOVER NUMBER)
n de mols de substrato convertido em
produto por mol de enzima em unidade de
tempo
 Unidades Enzimticas
Unidade Internacional
n de mols de substrato transformado ou
produto formado por mL de soluo por minuto
em pH e temperatura padronizados
UI= M/mL/min ou UI= M mL-1 min-1
Katal
n de mols de substrato transformado ou produto
formado por L por segundo em pH e temperatura
padronizados
K=M/L/s ou K=ML-1 s-1
Arbitrria
estabelecida pelo pesquisador
 Enzimas
Poder cataltico

n de renovao Poder cataltico

Velocidade mxima da reao

 Cintica enzimtica
1913
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maude Menten - Pediatra

Representaram uma reao

enzimtica em 2 etapas
K1 K3
E+S ES E +P
K2 K4

[produto]
K= constante de velocidade=
[substrato]
 Enzimas
Cintica enzimtica
K1 K3
E+S ES E +P
K2 K4

Estabilidade do complexo ES pode ser

expressa pela relao entre as velocidades
de dissociao e de formao do complexo

K2+ K3 Especfico
Km = para cada
K1
enzima
Enzimas - Cintica enzimtica

Km
Constante de Michaelis

Medida da afinidade do complexo

enzima-substrato (ES)

Especfico para cada enzima

 Cintica enzimtica
Michaelis e Menten expressaram matematicamente a
velocidade da reao pela frmula:

Onde Vm
Vm . [S]
V= velocidade mxima da
Km +[S] reao

Km+ [S]= [S]. Vm Quando V =Vm

V 2

Km= [S] . Vm . 2 S Km= [S]

Vm
 Cintica enzimtica
V

V mx

Vmax
2

[S]
Km= [S]

Numericamente, Km pode ser expresso como a

[substrato] necessria para que a velocidade da
reao seja metade da velocidade mxima
 Concluses sobre Km

Pequena [substrato]
Km necessria para a reao
atingir metade da Vmxima

Afinidade da enzima pelo substrato

 Concluses sobre Km

Grande [substrato]
Km necessria para a reao
atingir metade da Vmxima

Afinidade da enzima pelo substrato

 Concluses sobre Km
Km Afinidade da enzima pelo substrato

Km Afinidade da enzima pelo substrato

v
V

Vmx
V

V/2
V/2
1/V

Km Km
Km Km s
[s] -1/Km -1/Km
1/s
 Concluses sobre Km

Caracterstico de cada enzima

Reflete a afinidade da enzima pelo seu
substrato
numericamente IGUAL a [substrato]
na qual a velocidade da reao
metade da Vmxima
Concluses sobre a Cintica Michaeliana
Quando a Quando a [S] muito maior
[S] for menor que o Km (at que Km a velocidade da
atingir a saturao da enzima) reao constante e
a velocidade da reao igual a Vmax
proporcional [S] Reao de ORDEM ZERO
Reao de 1a ORDEM

[S]

Grfico caracterstico uma hiprbole

 Cintica Enzimtica
Devido asceno
gradual da curva
hiperblica No se pode
difcil determinar calcular com
quando foi atingida a exatido os valores
Vmx de Km e Vmx

[S]
 Cintica Enzimtica
Lineweaver e Burke Curva DUPLO-RECPROCA

1
= Km . 1 + 1
V Vmax [S] Vmax
1
V
Equao da reta
y= ax + b
a= inclinao da reta 1
b= intercepto em y Vmax

-1 1
Km [S]
 Cintica Enzimtica
Importncia de conhecer o Km das enzimas

Hexoquinase
Glicoquinase
Presente em todas as
Presente no fgado
clulas
Km=10mM
Km=30M
Capaz de
metabolizar mais
glicose conforme o
Saturada
aporte
Aps refeies [glicose] na veia porta
heptica da ordem de mM
Cintica Enzimtica
 Cintica Enzimtica

Enzimas Michaelianas
Enzimas Alostricas
 Cintica Enzimtica
No-Micheliana Enzimas ALOSTRICAS

Curva sigmide
Caracterstica das
enzimas alostricas

Afinidade da enzima Modifica com a variao da

pelo substrato concentrao do substrato
 Enzimas Alostricas
Oligmero

Formado por
subunidades idnticas

Protmeros (cada subunidade)

Centro Ativo Centro Alostrico

Moduladores ou Efetores Positivos

Substrato Negativos

Mudana de conformao

Alterao na atividade
 Enzimas Alostricas
[Efetor positivo] Todas as molculas da
enzima na forma R

[substrato]

Curva
hiperblica
CINTICA
MICHAELIANA
Curva
sigmide
 ENZIMAS
NOMENCLATURA

Sculo XIX - poucas enzimas identificadas

- Adio do sufixo ASE ao nome do substrato:

* gorduras (lipo - grego) LIPASE

* amido (amylon - grego) AMILASE

- Nomes arbitrrios:
* Tripsina e pepsina proteases

57
 ENZIMAS
NOMENCLATURA

1955 - Comisso de Enzimas (EC) da Unio

Internacional de Bioqumica (IUB) nomear e classificar.

Cada enzima cdigo com 4 dgitos que caracteriza o

tipo de reao catalisada:
1 dgito - classe
2 dgito - subclasse
3 dgito - sub-subclasse
4 dgito - indica o substrato

58
 ENZIMAS
CLASSIFICAO
Classificao das enzimas segundo a Comisso de Enzimas.

1. Oxido-redutases (reaes de oxidao-reduo ou transferncia de eltrons)

1.1.atuando em CH-OH
1.2.atuando em C=O
1.3.atuando em C=O-
1.4.atuando em CH-NH2
1.5.atuando em CH-NH-
1.6.atuando em NADH, NADPH
2.Transferases (transferem grupos funcionais entre molculas)
2.1.grupos com um carbono
2.2.grupos aldedo ou cetona
2.3.grupos acil
2.4.grupos glicosil
2.7.grupos fosfatos
2.8.grupos contendo enxofre
3.Hidrolases (reaes de hidrlise)
3.1.steres
3.2.ligaes glicosdicas
3.4.ligaes peptdicas
3.5.outras ligaes C-N
3.6.anidridos cidos 59
 ENZIMAS
CLASSIFICAO
Classificao das enzimas segundo a Comisso de Enzimas.

4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua,

amnia e gs carbnico)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N-
5.Isomerases (transferncia de grupos dentro da mesma molcula para formar ismeros)

5.1.racemases

6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre

duas pr-existentes, sempre s custas de energia)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C

60
 ENZIMAS
CLASSIFICAO
Subclasses

Exemplos de Tipo de reao catalisada Classe

Subclasses
Hidratases Adicionam H2O ligas duplas Liases
Quinases Transferem fosforilas do ATP Transferase
Mutases Movem fosforilas dentro da Isomerase
mesma molcula
Sintases Sntese independente de ATP Transferases
Sintetases Sntese dependente de ATP Ligases

61
 ENZIMAS
NOMENCLATURA

ATP + D-Glicose ADP + D-Glicose-6-fosfato

IUB - ATP:glicose fosfotransferase

E.C. 2.7.1.1
2 - classe - Transferase
7 - subclasse - Fosfotransferases
1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila
como receptor
1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato

Nome trivial: Hexoquinase 62