Técnicas de Eletroforese

e Cromatografia

Prof. Dr. Maximiliano Zierer

 Princípios da Eletroforese
• A eletroforese é uma metodologia utilizada para separar,
identificar e purificar macromoléculas (DNA, RNA, proteínas,
polissacarídeos).

• As partículas carregadas inseridas no gel migram quando sob

influência de um campo elétrico. As moléculas migram de
acordo com o seu tamanho, forma e carga elétrica aplicada.

• A separação dos fragmentos por eletroforese é baseada

nestas diferenças. São utilizados géis de agarose ou de
poliacrilamida para a eletroforese de ácidos nucléicos ou
proteínas.

• O DNA tem carga elétrica negativa e migra em direção ao

eletrodo positivo.
• Eletroforese é uma técnica de separação de moléculas que
envolve a migração das mesmas em um determinado gel durante
a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são
separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de
menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior
massa. Em alguns casos, o formato da moléculas também influi,
pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.
 Eletroforese de DNA
• O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA
baseia-se na carga total negativa do DNA (dada pelos oxigênios
do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da
técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma
voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão
próximas ao pólo positivo.

• Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade de

migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrerão
uma distância maior ficando mais próximas do pólo positivo.

• Na técnica, utiliza-se um cuba com dois compartimentos

separados. Os eletrodos determinam os pólos positivo e negativo
em cada compartimento. Neles, coloca-se uma solução salina que
conduz eletricidade.
•
• Entre os compartimentos, ajusta-se o gel que deve ficar
submerso. As amostras de DNA são colocadas com pipetas em
pequenos poços no gel, que são feitos com um pente durante a
sua preparação. Antes, porém, elas são misturadas a um corante,
chamado gel loading buffer. Esse corante é uma solução composta
de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado
para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas
saiam dos poços, além de dar a coloração que serve como
indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplica-se
voltagem e corrente elétrica ao sistema.

• A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de

aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de
tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses
fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular),
misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e
equidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no
início do processo.
• Tanto na eletroforese com gel de poliacrilamida como na com gel
de agarose, a separação das moléculas terá sua eficácia
determinada tanto pela concentração do polímero como pela
intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.

• A eletroforese em gel de agarose é empregada rotineiramente

para separação de ácidos nucléicos. A agarose é um polímero
extraído de algas marinhas. Forma uma rede que “segura” as
moléculas durante a migração.

• Dependendo da concentração de agarose, tem-se uma diferença

no gradiente de separação. Quanto maior a concentração, maior a
capacidade de distinguir fragmentos, ou seja, maior a definição. Os
géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de
brometo de etídio (EtBr), uma substância intercalante que revela
os ácidos nucléicos ao fluorescer sob luz ultravioleta.
Eletroforese em gel de agarose
• A poliacrilamida é uma
mistura de dois polímeros:
acrilamida e bisacrilamida. A
acrilamida é uma molécula
linear, enquanto que a
bisacrilamida é em forma de
"T". Misturando essas duas
moléculas, tem-se a
formação de uma "rede".

• Diferentes relações entre as

concentrações dessas
moléculas permitem a criação
de diferentes gradientes de
separação.

• A identificação dos produtos

também pode ser feita pelo
brometo de etídio.
 Principais diferenças entre o gel de agarose
e o gel de poliacrilamida

• Os poros nos géis de agarose são maiores do que nos géis de

poliacrilamida.

• Os géis de agarose são utilizados para separar fragmentos

grandes de DNA (≈500 pb até ≈20 kb) enquanto os géis de
poliacrilamida são utilizados para separar fragmentos pequenos
fragmentos de DNA (de 1 nucleotídeo até ≈2 kb).

• Os géis de agarose são horizontais, mas os de poliacrilamida

são verticais (preparados entre duas placas de vidro com um
afastamento de alguns milímetros apenas, porque o oxigênio do
ar inibe a polimerização da poliacrilamida).
• Southern blot

• Northern blot

• Western blot
 Southern blot
• O Southern blot é um método da biologia molecular que serve
para verificar se uma determinada seqüência de DNA está ou não
presente em uma amostra de DNA analisada. Isso é feito por meio
do realce do resultado de uma eletroforese em gel de agarose,
conforme será descrito mais adiante. O método foi batizado com o
nome de seu inventor, o biólogo britânico Edwin Southern, e isso fez
com que outros métodos de blot fossem batizados com trocadilhos
ao nome de Southern, por exemplo, Western blot e Northern blot.

• O método tem várias etapas, sendo que a primeira etapa é a

desnaturação: o gel onde foi feita a eletroforese de DNA é tratado
com uma solução alcalina (tipicamente contendo NaOH) para
promover a desnaturação da dupla fita do DNA, separando-a em
simples fitas. A desnaturação é necessária porque o DNA nas
etapas seguintes irá aderir à uma membrana e parear com uma
sonda.
 2ª etapa: Transferência do DNA para uma membrana

• Uma membrana de nitrocelulose (ou de nylon) é posta sobre o

gel. Uma pressão é aplicada uniformemente sobre o gel (tanto
usando-se sucção, ou pondo-se sobre a membrana uma pilha
de toalhas de papel com um peso em cima).

• Isso faz com que o DNA passe do gel para a membrana, onde
ele se adere.

• A membrana é então aquecida (no caso da nitrocelulose) ou

exposta a radiação ultravioleta (no caso do nylon) para
permanentemente ligar o DNA à membrana.
 3ª etapa: Tratamento com a sonda

• A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora - que

é uma molécula de DNA isolada cuja seqüência é conhecida e é
idêntica, ou então complementar, àquela seqüência a qual se quer
determinar a presença ou não na amostra (como as duas fitas da
dupla hélice do DNA são complementares uma a outra, tanto faz
escolher uma sonda que seja idêntica ou complementar à
seqüência procurada).

• A sonda de DNA é marcada de tal forma que permita ser

detectada a sua presença, essa marcação é normalmente feita
incorporando-se a ela átomos radioativos ou ligando-se a ela
corantes fluorescentes ou cromogênicos (substâncias incolores
que produzem cor ao interagirem com um determinado meio). Em
alguns casos, a sonda hibridizadora pode ser feita de RNA, em
vez de DNA.
• A sonda irá parear com qualquer seqüência de DNA
complementar a ela. Portanto se a seqüencia procurada não
estiver presente na amostra não haverá o pareamento.

• O excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não

hibridizada (não pareada) será removida. Depois disso, a presença
ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está
presente) é revelada por uma auto-radiografia em um filme de raio-
X, ou pelo aparecimento de uma cor, caso a marcação
cromogênica tenha sido usada.

• Como resultado, manchas no Southern Blot mostram onde a

sonda se hibridizou com a amostra. Conhecendo-se os pontos
onde a amostra de DNA foi clivada, é possível então dizer em
quais trechos a seqüência procurada está ou não presente.
 Northern blot
• O Northern blot estuda o perfil de expressão de mRNA; onde,
quando e quanto de determinado mRNA (que corresponde à
expressão de um gene) está presente numa dada amostra.

• É uma das formas mais simples de determinar em que altura certos

genes estão sendo expressos em sistemas vivos. Neste processo, o
RNA é separado numa eletroforese em gel, transferido para uma
membrana e detectado de forma similar ao DNA no Southern blot.

• Assim, o Northern blot permite: detectar a presença de um mRNA

específico; estimar a dimensão do mRNA, relativamente a RNAs
marcadores; estimar a quantidade relativa do mRNA (por
comparação do sinal de hibridação com o de outros genes que são
expressos em níveis conhecidos); detectar a presença de transcritos
diferentes de um gene específico (splicing alternativo, promotores
alternativos).
Resumo: etapas de Northern e Southern blot
(A) Misturas de moléculas de RNA de cadeia simples (Hibridação
Northern) ou de moléculas de DNA de cadeia dupla obtidas por digestão
com enzimas de restrição (Hibridação Southern) são separadas por
eletroforese com base na sua massa molecular.

(B) As moléculas de RNA ou os fragmentos de DNA desnaturados por

exposição do DNA a condições alcalinas desnaturantes, são transferidos
para membranas de nitrocelulose ou de nylon.

(C) A membrana, contendo os ácidos nucléicos ligados, é

cuidadosamente removida do gel.

(D) A membrana é depois colocada num saco de plástico selado ou numa

garrafa de hibridação, juntamente com a solução de hibridação (uma
solução salina tamponada) e a sonda de DNA ou de RNA,
radioativamente marcada e na forma de cadeia simples, por um período
de tempo prolongado em condições que favorecem a hibridação.
(E) A membrana é em seguida removida do saco ou da garrafa de
hibridação e lavada vigorosamente, de modo que apenas as moléculas
de sonda que hibridizaram com o RNA ou o DNA imobilizado na
membrana permanecem ligadas. Após auto-radiografia, o DNA ou o RNA
que hibridizou com a sonda marcada é visualizado como uma banda.
 Western blot
• O Western blot usa o mesmo princípio do Southern blot e do
Northern blot mas é aplicado a proteínas. Estas são separadas
usando eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença do
detergente dodecil sulfato de sódio (SDS).
• O western blot usa eletroforese em gel para separar as
proteínas desnaturadas. A separação é por massa. As proteínas
são então transferidas do gel para uma membrana (tipicamente
de nitrocelulose), onde foram usados como sonda anticorpos
específicos à proteína. Como um resultado, os pesquisadores
podem examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra
e comparar os níveis entre diversos grupos.

• Por exemplo, o teste para HIV emprega um Western blot para

detectar o anticorpo anti-HIV na amostra de soro humano.
Proteínas de células conhecidas infectadas com o HIV são
separadas e "blotadas" em uma membrana. Então, no soro a ser
testado é aplicado o anticorpo primário no passo de incubação; o
anticorpo livre é lavado, e um anticorpo anti-humano secundário é
ligado, e uma enzima reveladora é adicionada. As bandas
impregnadas então indicam os anticorpos do soro dos pacientes
marcados com o anticorpo anti-humano.
Cromatografia de afinidade
Cromatografia de afinidade

Purificação de proteínas de ligação a

DNA por cromatografia de afinidade:

Na etapa 1, as proteínas de ligação ao

DNA são separadas das restantes
proteínas celulares numa coluna com
diferentes sequências de DNA.

A fraca afinidade por DNA não

específico resulta de atrações iônicas,
sendo as proteínas removidas por
uma solução com uma concentração
moderada de sal.
Cromatografia de afinidade

• Na etapa 2, a coluna contém apenas

uma sequência particular de DNA, e
as proteínas retidas devido a
interações não específicas são eluídas
por soluções de concentração
moderada de sal, deixando na coluna
as proteínas (em geral apenas uma)
fortemente ligadas à sequência de
DNA.

• Estas proteínas são eluídas da

coluna por soluções contendo uma
concentração muito elevada de sal.