Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional interdisciplinaria de biotecnología

“Determinación de actividad enzimática y efecto de la concentración de enzima. ”

Equipo 4:
•Pérez Escalona Jairo Janai
•Campos Sánchez Gerardo
•Colín Álvarez Bryan Iván
•Bermeo Fernández Luis Antonio
PROFESORES
•Serrano Olvera Brenda Marie Dr. Luis Carlos Fernaá ndez Linares
Dra. Maríáa del Carmen Oliver S
Dr. Peá rez Solíás Erick Emmanuel
 Introducción
Las enzimas son proteínas con capacidad catalítica, es decir, reducen
la energía de activación de la reacción para acelerar la reacción. Las
enzimas transforman el sustrato y se obtiene un producto, pero a
diferencia del producto que sufre una transformación, la enzima no
sufre ningún cambio después de realizada la reacción; para que se
lleve a cabo la reacción es necesario que la enzima y el sustrato
estén en contacto
 Introducción
La capacidad catalítica de una preparación de enzimas se le llama Actividad Enzimática, se puede determinar al
cuantificar, ya sea la disminución de sustrato o la formación de producto. Obteniéndose la velocidad de
formación de producto o consumo de sustrato.
OBJETIVOS
Objetivo General
Analizar el efecto de la concentración de enzima en la actividad enzimática

Objetivos Específicos
Determinar la actividad enzimática de la invertasa.
Calcular las unidades de actividad enzimática.
Determinar el efecto de la concentración
Metodologia
Se preparó un baño maría en ebullición y un baño en hielo
Se prepararon 36 microtubos de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo DNS, protegiéndolos de
la luz
Se preparó un microtubo de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo DNS y 0.1 ml del regulador
de fosfatos en que se preparó la enzima, se utilizó el tubo como blanco del ensayo.
Después se preparó otro microtubo de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo de DNS y 0.1 ml de
la solución de sacarosa, siendo el tubo testigo de ensayo enzimático.
En 9 tubos Eppendorf se agregaron 0.95 ml de la solución de sacarosa al 3%, 3 tubos
para cada concentración de enzima.
A 3 tubos se le añadió por intervalos de 30 segundos 0.05 ml de solución de invertasa
Al pasar 1 y 3 minutos se agregó 0.1 ml de la solución de reacción y se transfirió a
otro tubo con 0.1 ml de DNS por duplicado
Se hicieron los puntos 5 y 6 con las demás concentraciones de enzima.
Al terminar la cinética enzimática se trataron los microtubos junto con el blanco y el
testigo con la técnica de determinación de azucares reductores.
En cada una de las soluciones enzimáticas proporcionadas por el profesor se
determinó la concentración de proteína por método Bardford y UV
Utilizando la ecuación de la curva patrón de glucosa se interpolo las absorbancias
para calcular las concentraciones de azucares reductores y las actividades enzimáticas
 Resultados
Tabla 1: Determinación de la concentración real de enzima
Absorbancia
Absobancia a 590 nm
a 280 nm Concentración
Concentración Concentración
real Bradford
Aparente real UV (mg/mL)
(mg/mL)
1 1 2 3

0.1 0.038 0.183 0.181 0.176 0.126 error

0.3 0.115 0.549 0.542 0.528 0.236 0.054

0.5 0.192 0.915 0.903 0.880 0.345 0.110

 Tabla 2: Absorbancias a 540 nm para la determinación de azúcares
reductores

Absorbancia a 540 nm
Concentr
ación tiempo de Desviaci
Prom
real de la reacción 1 2 3 4 5 6 ón
edio
enzima (min) estándar
(mg/mL)

1 1.197 1.123 1.028 0.961 0.889 1.09 1.048 0.11

0.345
3 1.046 1.231 1.261 1.13 1.044 1.476 1.198 0.16
0.589
1 0.21 0.678 0.65 0.721 0.633 0.645 0.19
0.236 5
3 1.009 0.716 0.813 0.748 0.846 0.872 0.834 0.10
0.175
1 0.167 0.184 0.134 0.267 0.147 0.154 0.05
5
0
0.126 .
3 7 0.657 0.07
3
0.669 0.669 0.588 0.731 1 0.553
A partir del promedio de las absorbancias se determinó la
concentración de azucares reductores utilizando la curva tipo
de la capacitación 4, cuya ecuación es:

Donde C es la concentración de azúcares reductores en g/L.

Usando la ecuación 3 se determinó la concentración de producto a cada tiempo

(1 y 3 minutos)

Donde Cf es concentración al tiempo final tf y Ci es la concentración al tiempo

inicial ti del intervalo tomado
.
Por último dado que se conocida la cantidad de enzima que se adicionó se
determinó la actividad enzimática específica a partir de la cantidad de
enzima real calculada mediante la ecuación 4.

Donde la concentración de enzima se debe expresar en unidades de mg/L

y se refiere a los miligramos de enzimas adicionados a un litro de mezcla
de reacción.
 Tabla 4: AE Y AE específica
Actividad
Concentració Actividad enzimátic
Intervalo de Promedio de Concentraci Sacarosa
n real de la enzimátic a
reacción las Dilución ón de AR consumid
enzima a (g/L especifica
(min) absorbancias (g/L) a (g/L)
(mg/mL) min) (g/L min
mg)
0-1 1.048 1 8.575 8.146 8.146 0.472
0.345
1-3 1.198 0.5 19.486 18.512 5.183 0.300
0-1 0.5895 1 5.004 4.754 4.754 0.699
0.136
1-3 0.834 0.5 13.816 13.125 4.186 0.616
0-1 0.1755 1 1.780 1.691 1.691 0.268
0.126
1-3 0.657 1 5.528 5.252 1.781 0.283
 Para el cálculo de UI, Katal y Kcat se ocuparon las
ecuaciones 5,6 y 7, respectivamente. Los resultados se
muestran en la tabla 5.

Tabla 5: Resultados de la actividad de la enzima

Concentraci Intervalo de UI Katal x105

ón real de reacción (μmol/L (mol/ L s Kcat (1/s)
la enzima (min) min mg) mg)
0-1 1380.800 2.3 6213.60
0.345
1-3 878.520 1.5 3953.34
0-1 2044.074 3.4 9198.33
0.136
1-3 1799.899 3.0 8099.55
0-1 784.654 1.3 3530.94
0.126
1-3 826.433 1.4 3718.95
 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Como se puede observar en la tabla 4 la actividad enzimática depende tanto

del intervalo donde se mida como de la concentración de enzima, la primera
es debido a que como se consume el sustrato, la concentración disminuye
hasta llegar al punto que existan enzimas que no se anclen al sustrato, es
decir, se agote el estado de saturación del sustrato como se muestra en la
figura 3, disminuyendo la actividad enzimática con respecto al tiempo. El
segundo, es debido a que cuando existe mayor cantidad de enzima para la
misma concentración de sustrato se transforman un mayor número de
moléculas en un intervalo de tiempo, esto es fácil ver como ayuda del Kcat,
por cada enzima se transforman en promedio 5,700 moléculas de sustrato
por segundo,
por consiguiente, al existir un mayor número de enzimas se
transformará una mayor cantidad de sustrato por segundo. Un resultado
bastante interesante también se observa en la tabla 4, con la actividad
enzimática en la concentración más baja en los dos intervalos, como se
observa aquí la actividad enzimática parece no variar mucho, esto se
debe a que al existir una cantidad relativamente pequeña de enzima el
estado de saturación se mantiene por mayor tiempo y el consumo del
sustrato con respecto al tiempo varia de forma lineal, este resultado es
de suma importancia ya que si estamos seguros que ocurre esto en un
intervalo de tiempo podemos estimar AE como la pendiente de la recta.
 Conclusiones

La cinética enzimática nos ayuda a entender el comportamiento de las transformaciones biológicas.
La concentración de sustrato en el tiempo influye en la actividad de la enzima
La concentración de la enzima influye en el valor de la actividad enzimática pero no de las otras
formas de medición al tratarse de propiedades extensivas
La mayor actividad enzimática se observó con la concentración más alta de enzima en el intervalo de
0 a 1 minuto, su valor fue de 8.14 g sacarosa/L*min
La actividad enzimática promedio fue de 0.44 g sacarosa/ L min mg enzima
La UI se encuentra en promedio de 1285 μmol/L min mg
El katal es aproximado de 2x10-5 mol/ L s mg
El kcat promedio es de 5,700 s-1.
Referencias

•Chang (2003), Fisicoquímica para sistemas biológicos, Editorial Mc Graw Hill. México DF, pp 14-21
•García González (1998) Bioquímica para ciencias de la salud, Editorial continental, México DF, pp
254-272.
•Lehninger. Principios de bioquímica (2006) David L. Nelson; Michael M. Cox. 4ª Edición. Ediciones
Omega.
•.Principios de Bioquímica (2001) Albert L. Lehninger, David L. Nelson; Michael M. Cox. (2ª y 3ª
edición). Ediciones Omega.
•Bárzana, E. y A. López-Munguía. 1995. La tecnología enzimática. En Biotecnología Alimentaria, pp.
103-123. Limusa, México D.F
•Christensen, H.N. y Palmer, G.A. (1980) Cinética enzimática. Ed. Reverté. Barcelona.