MÉTODOS DE ANÁLISIS DE

BIOMOLÉCULAS
 Métodos de análisis de proteínas
• Las proteínas se pueden separar en base a su
solubilidad, tamaño, carga, capacidad de unión.

• Para esto se pueden usar una serie de técnicas, entre

las siguientes:
– In vivo: Anticuerpos monoclonales
– Físicos: Cristalografía de rayos X, Resonancia magnética
nuclear (NMR), electroforesis, etc.
 Purificación de proteínas

• “Nunca desperdicies un pensamientos puros en una

proteína impura”.

• ¿Cómo separar las proteínas del material de

estudio?
– Bibliografía
– Ensayo-error
• Como obtener las proteínas?
– Squash?
– Licuadora?
– Centrifuga?
– Estufa?
• Luego de obtener el precipitado se somete a diferentes
separaciones basadas en diferentes propiedades.
• En cada paso se ensaya la actividad proteica deseada y
se determina su concentración
TÉCNICAS DE PURIFICACION
• PRECIPITACIÓN SALINA
– La mayoría de proteínas son menos solubles a
concentraciones altas de sal.
– Sales utilizadas: Sulfato amónico SO4(NH4)2
– Ejemplos: SO4(NH4)2 0.8M para precipitar Fibrinógeno
SO4(NH4)2 2.4M para precipitar Albumina del
suero.
• DIÁLISIS
TÉCNICAS DE PURIFICACION
• CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
Se usan columnas
rellenas de polímeros
insolubles, como pueden
ser:
 Carbohidratos:
Dextrano, Agarosa.
 Comerciales:
Poliacrilamida,
Sephadex, Sepharosa,
Biogel.
Tamaño: 0.1mm
TÉCNICAS DE PURIFICACION
• CROMATOGRAFÍA DE
INTERCAMBIO IÓNICO
• Se basa en la carga neta de la
proteína y el uso de grupos
carboxilato (COO-)
• Las proteínas cargadas
positivamente se pueden
separa en columnas de CM-
celulosa cargadas
negativamente. Se usa DEAE-
celulosa cargada positivamente
para el caso contrario.
TÉCNICAS DE PURIFICACION
• CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
• Esta técnica se basa en
interacciones bioespecíficas gracias
a las cuales la columna de
cromatografía de afinidad absorbe
únicamente de la muestra los
componentes que presentan
afinidad con los ligandos acoplados
al soporte cromatográfico.
• Ejemplo: Para aislar factores de
trascripción, proteínas que regulan
la expresión génica mediante la
unión a secuencias de ADN
TÉCNICAS DE PURIFICACION
• CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
(HPLC)
• En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido
que fluye a través de una columna que contiene a la
fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el
resultado de las interacciones específicas entre las
moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y
estacionaria.
• La HPLC es capaz de separar macromoléculas y
especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales
poliméricos y una gran variedad de otros grupos
polifuncionales de alto peso molecular.
TÉCNICAS DE PURIFICACION
TÉCNICAS DE PURIFICACION
• ELECTROFORESIS
TÉCNICAS DE PURIFICACION
• ISOELECTROENFOQUE
• Punto isoeléctrico (pl) de una proteína es el pH en el que
su carga neta es cero.
• Cada proteína se desplazará hasta que alcance una
posición en el gel en el que el pH es igual al pl
TÉCNICAS DE PURIFICACION
• ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
TÉCNICAS DE PURIFICACION
A nivel de proteínas se estudia o se busca medir lo sgte:
PROTEINA TOTAL: La cantidad de proteína presente en una
fracción se obtiene determinando la concentración de proteína
en una alícuota de cada fracción y multiplicándola por el
volumen total de la fracción.

ACTIVIDAD TOTAL: La actividad enzimática de la fracción se

obtiene midiendo la actividad enzimática en una alícuota de
cada fracción y multiplicándola por el volumen total de la
fracción.

ACTIVIDAD ESPECIFICA: Este parámetro se obtiene

dividiendo la actividad total por la proteína total.
TÉCNICAS DE PURIFICACION
RENDIMIENTO: Este parámetro es una medida de la
actividad existente después de cada paso de purificación
expresada como porcentaje de la actividad del extracto
crudo. la actividad del extracto inicial se toma como el
100%

GRADO DE PURIFICACION: este parámetro mide el

incremento en pureza y se obtiene dividiendo la actividad
especifica, calculada después de cada paso de
purificación, por la actividad especifica del extracto inicial.
TÉCNICAS DE PURIFICACION
ultra centrifugación

CENTRIFUGACIÓN: masa, densidad, formas de

moléculas, investigar interacciones moleculares. para
deducir estas propiedades a partir de los datos de
centrifugación, necesitamos una descripción matemática
de como se comporta una partícula en una fuerza
centrifuga.

Velocidad de movimiento: se realiza calculando el coef. de

sedimentación s.
TÉCNICAS DE PURIFICACION
TÉCNICAS DE PURIFICACION
Los coeficientes de sedimentación se expresan
normalmente en unidades Svedber (S), equivalentes a
10−13 s

Cuanto menor sea el valor S, la molécula se moverá mas

lentamente por la fuerza centrifuga.
TÉCNICAS DE PURIFICACION
Hay diferentes tipos de centrífugas según el rango de velocidades de giro:

A. Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas. De pequeño

tamaño y sin refrigeración. Alcanzan una velocidad máxima de 5000 rpm.
Útiles para la separación de partículas grandes como células o precipitados de
sales insolubles.
Las centrífugas micrófugas son una variante de las anteriores que permiten
llegar a velocidades de más de 10.000 rpm, siendo los volúmenes de trabajo
muy pequeños. Son útiles en el campo de la biología molecular.
B. Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000 y
25.000 rpm. Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vacío para evitar el
calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son útiles en la
separación de fracciones celulares, pero insuficientes para la separación de
ribosomas, virus o macromoléculas en general.
C. Ultracentrífugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas
auxiliares de refrigeración i de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que
permiten la obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación
(coeficientes de sedimentación, pesos moleculares), y preparativas, útiles
para aislar partículas de bajo coeficiente de sedimentación (microsomas,
virus, macromoléculas).