Universidad Nacional del Centro del Perú

Facultad de Ciencias Agrarias

 MICROPROPAGACIÓN
Consiste en la propagación de
vegetales a partir, de un genotipo
selecto, generalmente, de ápices
o explantos nodales de una
planta madre. La gran producción
de nuevas plantas se ve
favorecida gracias al rápido
crecimiento del material vegetal
in vitro y a la proliferación de
tallos durante los subcultivos.
 Programa de micropropagación
• Etapa 0: Selección y acondicionamiento de la planta madre.
• Etapa I: tratamientos de asepsia y establecimiento del cultivo
mediante.
• Etapa II: Desarrollo y multiplicación de los brotes
• Etapa III: enraizamiento o acondicionamiento de los brotes para su
aclimatación a condiciones ex vitro.
• Etapa IV: Aclimatación a condiciones ex vitro.
 Medios de cultivo
Un medio de cultivo es una solución acuosa en donde se
encuentran disueltas sales minerales que aportan los elementos
esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes
(Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una
fuente de carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa
actividad fotosintética de los tejido in vitro. Además, el medio puede
ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del
crecimiento.
Preparación de medios de cultivo
Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones
concentradas 10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la
solución madre se pueden mezclar varias sales minerales
siempre que no se produzcan problemas de precipitación.
Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos
para mantener su disponibilidad durante el cultivo.
 Medios de cultivo químicamente
definidos
Son medios de cultivo que se caracterizan por su composición
química es decir que se conoce exactamente la cantidad de cada uno
de los compuestos que hay en el medio; se conocen tanto como
(cualitativa y cuantitativamente) posteriormente se detallan algunos de
los medios de cultivos.
 Tipos de medio de cultivo
Medio de cultivo de (murashige y skoog)
Micronutrientes y vitaminas
 Preparación del medio de cultivo
(Murashige & Skoog)
Para la realización del medio de cultivo MS se elaboran las siguientes
soluciones Madre:
Todas las soluciones se preparan sobre un 70% de agua del volumen
final deseado, y sobre ella se van añadiendo uno por uno todos los
componentes hasta su completa disolución. Posteriormente se ajusta el
volumen final con agua y se almacenan.

 Usar 100 ml de la solución stock de macronutrientes para preparar 1

L de medio de cultivo MS.
 Stock de Calcio (x10)

 Usar 100 ml de la solución stock de Ca para preparar 1 L

de medio de cultivo MS.
 Stock de micronutrientes (x1000)

 Usar 10 ml de la solución stock de micronutrientes para

preparar 1 L de medio de cultivo MS.
 Stock de Fe-EDTA( x100)
El hierro se puede añadir quelado como producto comercial (por
ejemplo, Secuestrene) o preparando el siguiente stock:

 Disolver 3,72 g de EDTA disódico en 900 mL de agua destilada.

Se obtendrá una solución clara a los 15 min a temperatura
ambiente (25 - 27ºC).
 Añadir 2,78 g de sulfato ferroso heptahidratado. Se obtendrá
inmediatamente una solución de color amarillo claro.
 Enrasar a 1 L y almacenar la solución de hierro quelado en una
botella ámbar para protegerla de la exposición a la luz.
 Usar 10 ml de la solución stock de hierro quelado para preparar
1 L de medio de cultivo MS.
 Stock de Vitaminas (x 100)
Usar 10 ml de la solución stock de vitaminas para preparar 1 L de
medio de cultivo MS.
Stock de reguladores de crecimiento.
 Funciones de los reguladores y
hormonas vegetales
 Las auxinas se puede disolver en una pequeña cantidad de
etanol al 95%, KOH o NaOH 1 M. una vez disueltas se añade
agua destilada, procurando que las auxinas no se precipiten,
hasta alcanzar el volumen deseado.
 El àcido abscisico se puede disolver en NaOH 1 N y la
geberelinas en etanol al 95%.
 La citoquininas se disuelve en HCL 0,5 N se puede calentar
suavemente para favorecer a la disolución para obtener el
volumen deseado.
 Preparación del medio de cultivo de
Murashige & Skoog
La elaboración de los medios de cultivo se realiza diluyendo las
soluciones madre previamente realizadas. Además, se añade la
fuente de carbono y el agente gelificante, que normalmente es
agar. Se pueden hacer distintos medios de cultivo manteniendo
la misma concentración de algunas sustancias, por ejemplo sales
minerales y vitaminas, y modificando o eliminando otras como
los reguladores de crecimiento.
Tomando como base las sales minerales, vitaminas y fuente de
carbono de Murashige y Skoog se pueden realizar múltiples medios
de cultivo variando los reguladores de crecimiento o su
concentración. Por ejemplo, se pueden realizar los siguientes medios
de cultivo:

Donde:

 - MS-0: medio MS sin reguladores

 - MS-K: MS con 0.3 mg/L de ácido indol-acético y 1 mg/L de
kinetina
 - MS-R: MS con 1 mg/L de AIB
 Preparación definida

Para preparar 1L de estos medios se realiza el siguiente proceso:

 Colocar en un agitador magnético una jarra de 1 L de capacidad con
unos 400 ml de agua destilada y añadir los elementos minerales y
las vitaminas:
- 100 ml del stock de macronutrientes.
- 100 ml del stock de Ca,
- 1 ml del stock de micronutrientes,
- 10 ml de la solución hierro EDTA (ó 0.2g/L de secuestrene)
- 10 ml del stock de vitaminas.
 Adicionar la cantidad estimada de las soluciones de fitohormonas.
 30 g sacarosa y esperar a que se disuelva.
 Añadir agua destilada hasta un volumen de 1L
 Colocar la mezcla en una jarra y ajustar, en un pHmetro, el pH del
medio (con KOH, NaOH ó HCl) hasta 5.8.
 Añadir 7,5 g de agar y disolverlo en el autoclave o en microondas.
 Agitar el medio, dosificarlo en los recipientes de cultivo y colocar
las tapas.
 Esterilizar el medio en el autoclave durante 20 min a 120oC y 1
Kg/cm2 de presión.
 Dejar enfriar el medio antes de su utilización
 Observaciones

Si algún componente fuera termolábil habría que esterilizarlo

por filtración con una jeringuilla y un filtro de un tamaño de
poro menor de 0.22 μm. Este proceso habría que realizarlo
en una cámara de flujo laminar y emplear material estéril.
 Knudson (1946)
El primer medio conocido es el adecuado para de orquídeas,
bastante pobre en sales.
Macronutrientes
(NH4)2SO4 0.5 g/l
MgSO4 0.122 g/l

Ca(NO3)2 0.694 g/l

KH2PO4 0.250 g/l

Micronutrientes
KI 0.83 mg/l

H3BO3 0.056 mg/l

MnSO4.H2O 5.68 mg/l

MoO3 0.016 mg/l

CuSO4.5H2O 0.062 mg/l

FeSO4.7H2O 25.0 mg/l

 White (1963)
Es uno de los medios, si no el mas, diluido de que se dispone, y por
lo tanto de uso complementario al MS. Se elaboró para cultivo de
raíces de tomate.
Macronutrientes
Ca(NO3)24H2O 0.3 g/l
KNO3 0.08 g/l
MgSO4.7H2O 0.72 g/l
Na2SO4 0.2 g/l
NaH2PO4.H2O 0.019g/l
Micronutrientes
KCl 65 mg/l
KI 0.75 mg/l

H3BO3 1.3 mg/l

MnSO4.7H2O 7 mg/l
ZnSO4.7H20 3 mg/l
Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/l

CuSO4.5H2O 0.025 mg/l

CoCl2.6H2O 0.025 mg/l

Na2.EDTA 37.3 mg/l

 B5 (Gamborg, 1970-1976)
Gamborg trabajó activamente en la elaboración de medios, a los
que dio diferentes números. EL B5 fue formulado para cultivo de
callo de soja.
Macronutrientes
(NH4)2SO4 0.134 g/l
KNO3 2.528 g/l
MgSO4.7H2O 0.246 g/l
CaCl2.aq 0.15 g/l
KH2PO4 0.15 g/l
Micronutrientes
KI 0.75 mg/l
H3BO3 3.0 mg/l
MnSO4.H2O 10 mg/l
ZnSO4.7H20 2.0 mg/l
Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/l

CuSO4.5H2O 0.025 mg/l

CoCl2.6H2O 0.025 mg/l
Na2.EDTA 37.3 mg/l
FeSO4.7H2O 27.8 mg/l
 Medios de cultivos indefinidos
Son medios de cultivo de los cuales no es decisivo conocer la
composición exacta. Por lo general se suele aplicar el uso del agua
de coco ya que este contiene reguladores de crecimiento análogos
a cinetina que estimula la división celular.

Sustancia
 Extractos: Levadura, malta, carne, patata, maíz, raíces y
rizomas
 Jugos de frutas u hortalizas: Naranja, banano, piña, tomate,
patata, leche de coco, agua de coco etc.
 Medio de cultivo para orquídeas

• se utilizan 3 tomates maduros cortados en trozos.

• 1 (plátano) maduro cortado en trozos
900 ml agua.
• 100 ml agua de coco.
• 4 tabletas de tiamina 300 mg (vitamina B1)
Grenetina o gelatina sin sabor
 MEDIOS DE CULTIVO
 Un medio de cultivo puede ser
definido como una formulación
de sales inorgánicas y
compuestos orgánicos inducidos
para la nutrición y manipulación
de los cultivos. Existen
numerosas formulaciones, cada
una de las cuales comprende
entre 5 y 40 compuestos
BASICAMENTE, LOS MEDIOS
CULTIVOS SE COMPONEN DE
COMPUESTOS QUE
SUMINISTRAN

 UNA FUENTE DE CARBONO

 NUTRIENTES MINERALES
 SUSTANCIAS VITAMINICAS
 SUSTANCIAS REGULADORAS DE CRECIMIEMTO
 AGENTE GELIFICANTE (En el caso de medios semisólidos)
 OTROS COMPUESTOS
 FUENTE DE
CARBONO
Prácticamente todo los cultivos
son heterótrofos
(comparativamente unos pocos
son autótrofos) y por ende
necesitan el suministro de una
fuente de carbono.
 NUTRIENTES MINERALES

Los medios de cultivos deben

suministrar los mismos macro y
micronutrientes que son
esenciales para el crecimiento de
las plantas enteras. En general se
destacan las concentraciones
relativamente alta de nitrógeno y
potasio.
 SUSTANCIAS VITAMINICAS

 De todas las que

comúnmente se
incorporan los medios,
pareciera que la tiamina es
la única realmente
imprescindible para el
buen crecimiento de los
cultivos.
SUSTANCIAS QUE NORMALIZAN EL
CRECIMIENTO

 En la mayoría de los casos los

medios utilizados para el
establecimiento de los cultivos
contienen auxinas (ANA, 2,4-D,
AIA, AIB, NOA, Dicamba,
Picloram) y/o citocininas (BA,
KIN, ZEA, 2iP, Thidiazurón
AGENTES GELIFICANTES

 (en el caso de medios semisólidos). El

agar (0.6 y 1%) es el compuesto más
utilizado. También pueden emplearse
“agargel” (0.40 – 0.60%), “Transfergel”
(2,0-2,60%), “Phytagel” (0.25 – 0.40%),
“agarosa” (0.80 – 0.90%) y gerllite (0.10
– 0.20%)
 OTROS COMPUESTOS

 Muchas sustancias, de variada

composición química. Suele ser
adicionada a los medios básicos.
Además de la glicina, otros
aminoácidos se pueden agregar a los
medios. Es el caso de la L-Tirosina,
asparagina y cisteína, aunque hay que
tener presentes que en dosis altas
pueden inhibir el crecimiento de los
cultivos.