Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Químico Farmacéutico Industrial
Departamento de Microbiología
Laboratorio de Microbiología General

AISLAMIENTO Y RECUENTO DE
BACTERIAS ANAEROBIAS

 Equipo 4 PROFESORES
INTEGRANTES
 .
 Lab 3  Aranda González Iván.
 .
 Robles Herrera Rubén.
 Grupo: 6FV01  .

1
 Bacterias anaerobias

No son capaces de usar

oxigeno
Obtienen energía por
procesos anaeróbicos

Obligados o estrictos Aerotolerantes

2
Son organismos que carecen de sistemas
respiratorios completos
No pueden producir energía mediante la
respiración aerobia
 Utilizan vías de fermentación
 Respiración anaerobia

Mueren en presencia de Oxigeno

 Son incapaces de eliminar los productos
tóxicos derivados del metabolismo del Ejemplo:
oxígeno  Clostridium botulinum
• Singlete de oxigeno
• Superóxido
• Peróxido de hidrogeno
• Hidroxilo

3
Pueden crecer en presencia de Oxigeno
 Sin que este participe en su metabolismo

Utilizan vías fermentativas o respiración

anaerobia para la producción de energía.
Han desarrollado mecanismos protectores
 Enzimas Ejemplo:
• Catalasa
 Streptococcus pyogenes
• Peróxidasa
• Superóxido dismutasa

4
 Técnicas y medios de cultivo para su aislamiento

Fácilmente ceden
Adicionando sustancias reductoras (-SH)
su H a otros
Potenciales reducidos de Eh <-0.2 V compuestos
orgánicos.

Sustituyendo el O2 por otro gas

Utilizando un sistema generador
de anaerobiosis.

Nitrógeno, bióxido
Cámaras de bioseguridad
de carbono,
III.
hidrogeno.

5
 El desplazamiento del oxígeno
Para ello existen distintos de la atmósfera de incubación o
métodos para llevarlo acabo: de los medios líquidos por
sustitución con otros gases (H2,
N2 o CO2) utilizando campanas
anaeróbicas.

Tubos con
tapones de Métodos físicos
rosca: sello
hermético.

Uso de aceite
mineral, nujol,
y vaselina
para evitar el
paso de O2
(poco soluble
en estos).
Llenado de los tubos con medio
hasta las ¾ partes de su volumen.
Calentamiento del medio
previo a su inoculación. Llevar
el medio a condiciones
extremas de temperatura,
permitiendo la activación de
las esporas que pudiesen
existir en el microorganismo.
Eliminar el Oxigeno disuelto.

Fondo concentración de
oxigeno muy baja .

6
 O Na
Tioglicolato de HS
sodio
O

Se combina
químicamente con el
oxigeno disuelto
disminuyéndolo del Su grupo sulfhidrilo
Métodos Químicos
medio de cultivo. fácilmente cede sus
hidrogeno a otros
Medios compuestos
reductores orgánicos.

O
Cisteina
H 2 N C H C O H

C H 2

S H

7
8
En medio sólido, se emplean jarras de
anaerobiosis con sistema Gas Pak. NaBH4 + 4H2 H2O+ Na2B4O7

Contienen NaHCO3 y NaBH4.

Se añade agua al sobre, y se libera H2 y CO2.

Ac. Cítrico + NaHCO3 CO2 + citrato de Na

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Técnica de diluciones en tubo: Número
Más Probable
 Es una técnica estadística eficiente de estimación de densidades poblacionales

 Útil cuando los microorganismos que se desea contar no son capaces de

crecer en medios sólidos.
 También cuando el crecimiento de las bacterias en un medio líquido y
diferencial se utiliza para identificar ciertos microorganismos

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OBJETIVOS:
• Conocer algunas técnicas y medios de cultivo para el
aislamiento, recuento y cultivo de bacterias anaerobias
.
• Observar el efecto de los diferentes potenciales de
oxido reducción de los medios de cultivo sobre el
crecimiento de microorganismos aerobios, anaerobios
estrictos y anaerobios estrictos.

• Estimar la población de microrganismos anaerobios

estrictos por el método del numero mas probable.

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 Metodología
Adicionar 1 g de Tomar asada del
muestra a un tubo que Homogeneizar y dejar sobrenadante y sembrar por
contiene 9 mL agua sedimentar estría cruzada en placas agar
destilada TSN y tioglicolato

Homogenizar y calentar
dejar enfriar y Colocar placas en jarra
en baño de agua en
sedimentar de anaerobiosis
ebullición 5minutos

12
 Colocar gota de Colocar en el fondo de la jarra
Clostridium sp. En Colocar una placa
un agente desecante, en la
gelosa sangre y TSN gelosa sangre y TSN en
pared de oxido reducción y un
por estría cruzada jarra de anaerobiosis
catalizador

Agregar 10 mL de agua Realizar tinción de

Incubar a 37℃ durante
al sobre de GasPak y Gram
48 h
cerrar inmediatamente

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 Sembrar por triplicado 1mL
Hacer serie de de cada dilución en tubos Incubar a 47℃ durante
diluciones hasta 10−3 de 10mL leche-fierro con 48 h
sello de aceite mineral

Estimar NMP/g

14
 Comparación del crecimiento en medio
líquidos de diferente potencial de oxido
reducción
Inocular con pipeta Pasteur el
Incubar a 47℃ durante 48 h
fondo de los tubos de caldo

Observar el crecimiento y su
localización en los medios de
cultivo

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Resultados: (1) Colstridium
Característica Colonia 1 Colonia 2
sp.
Medio de Agar Agar
Gelosa Sangre
cultivo tioglicolato tioglicolato
Forma Circular Circular Amiboide
Tamaño 0.5 mm 0.5 mm 0.6 mm
Color Blanco Blanco Grisasea
Ondulada
Borde Entero Entero (cabeza de
medusa)
Superficie Lisa Lisa Lisa
Elevación Convexa Convexa Plana
Luz
Traslucida Traslucida Opaca
transmitida
Luz reflejada Brillante Brillante Mate
Aspecto Húmedo Húmedo Seco
Consistencia Suave butiroso Suave butiroso Suave butirosa
Acción sobre
- - β hemolisis
el medio
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Resultados: (2-3)

Clostridium sp. Colonia 1 Colonia 2

Clostridium
Característica Colonia 1 Colonia 2
sp.
Forma Cocobacilo Coco Bacilo
Agrupación tétradas NO NO
Tinción gram G- G+ G+
Endoesporas NO NO SI

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Resultados: (5)

Bacillus subtilis Escherichia coli Clostridium sp.

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Cuestionario
oMencione cinco ambientes naturales a partir de los cuales se pueden aislar
microorganismo anaerobios estrictos (no incluir suelo ni materia fecal)
Aguas residuales , pantanos, superficie de la piel, superficies mucocutaneas,
estomago de ganado
oExplique con formulas las reacciones químicas que ocurren en el sobre de
GasPak® y de Anaerogen dentro de la jarra de anaerobiosis ,como se
obtiene la atmosfera anaerobia y como funciona el indicador
NaBH4 + 2 H2O NaBO2 + 4 H2↑
C3H5O(COOH)3 + 2 NaHCO3 + [CoCl2] C3H5O(COONa)3 + 3 CO2 + 3 H2 + [CoCl2]
2 H2 + O2 + [Pd Catalizador] 2 H2O + [Pd Catalizador]
Indicador REDOX
Azul de metileno Oxidado (Azul) Azul de metileno Reducido (Incoloro)

19
20
o¿Por qué un microorganismo facultativo puede crecer en ambientes
oxidantes o reductores?
Por que pueden desarrollar un metabolismo respiratorio aerobio
usando el oxigeno presente o tipo fermentativo en ausencia de este
o¿Cómo se producen las condiciones anaeróbicas en el medio de leche-
fierro?
El hierro contenido en el tubo, activara como agente reductor
consumiendo el oxigeno contenido en el tubo generando una atmosfera
reducida

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