KARAKTERISASI GENOMIK DAN

PROFIL PROTEIN BAKTERI ASAM

LAKTAT INDIGENOUS SUSU KUDA LIAR
NUSA TENGGARA BARAT

RUBIYATNA SAKARONI
176090100111006
 pendahuluan

Susu Fermentasi Kuda Liar NTB pH 3

Fermentasi alami dengan Bantuan kelompok

mikroba

Pembantu fermentasi, Sumber probiotik,

Sumber zat antimikroba.

Karakterisasi BAL berdasarkan Profil genomik dan

protein
 Karakterisasi genotipik
• Internal Transcribed Spacer (ITS) & Spacer Region
5,8S
RUMUSAN MASALAH
1. Bagaimana kualitas dan kuantitas DNA BAL asal susu
kuda fermentasi?
2. Bagaimana karakter profil protein yang dihasilkan oleh
BAL ?

MANFAAT PRAKTIKUM
Hasil praktikum dapat digunakan sebagai informasi
komunitas BAL yang terlibat dalam proses fermentasi
susu kuda secara tradisional. Serta, informasi terkait
profil protein dapat digunakan sebagai pedoman
pertimbangan untuk penelitian lebih lanjut.
 Metode penelitian
Tahap 1: Isolasi DNA dan Amplifikasi its & 5,8S
• Empat isolat BAL indigenous susu kuda liar pada kultur
MRSB
• Isolasi DNA kromosomal, pemurnian DNA, presipitasi DNA

• Uji kualitatif gel agarose electrophoresis 0,8%

• Uji kuantitatif menggunakan Nanodrop

• Amplifikasi dengan PCR primer ITS dan 5,8S

• Uji Kuantitatif gel agarose electrophoresis 1,5%

 Metode penelitian
Tahap 2: Isolasi protein

• BAL pada kultur MRSB usia 18-24 jam

• Isolasi protein menggunakan buffer ekstrak,

pemurnian protein
• Berat molekul protein

• Uji pola pita menggunakan SDS PAGE

 (Fatchiyah dkk., 2011)
ISOLASI DNA

• 1,5 mL • Disentrifus 4250 rpm; 4 ºC; 15

min
dipindah ke Pelet
• Ditambahkan bufer lisis
Kultur BAL dalam tube 2 disuspensikan
(sukrosa 25% 40 µL; EDTA
pada MRSB mL dengan 0,5 M pH 8 10,5 µL; 1,5 µL
20 mL • Disentrifus EDTA 50 lisozim 10 mg/mL); divorteks
mM 60 µL sebentar
4250 rpm; 4
• Diinkubasi suhu 37 ºC; 1 h
ºC; 20 min • Suspensi ditambah 18 µL
NaCl 5 M; 10,5 µL EDTA 0,5
M; 22,5 µLSDS 20%; 1,5 µL
• Supernatan dipindah ke tube berisi proteinase-k 5 mg/mL;
2x vol etanol absolut dingin; divorteks sebentar
dikocok dua kali • Diinkubasi suhu 50 ºC; 1 h
• Disentrifus 10.000 rpm; 4ºC; 5 • Ditambah kloroform 1x
min volum; dikocok 20 menit pada
suhu 25 ºC
• Pelet ditambah 2x vol etanol 70
%; divorteks 5 min (2x ulangan)
• Disentrifus 10.000 rpm; 4 ºC; 5 Disentrifus 4250 rpm;
min 25 ºC; 30 min
• Pelet ditambahkan dengan TE
bufer pH 7,6 30 µL
 UJI KUALITATIF DNA

0,8 % agarose
+ EtBr 1 µL
0,16 g dalam 20
mL TBE buffer
1x;; dipanaskan

Running 100V; 30
Menit

Genom+Loading dye
(1:1)
Visualisasi Pita
DNA Ladder 100 bp
DNA
UJI KUANTITATIF DNA

DNA template
NanoDrop
1 µL
 AMPLIFIKASI GEN TARGET
Tabel 1. Primer PCR

Suhu
Sekuen basa Amplikon
Primer* Target Annealing Pustaka
nukleotida (5’-3’) (bp)
(ºC)

TTG TAC ACA CCG

R139-F ITS CCC GTC (Rachman

49 500-1200
23S/p7-R region GGT ACT TAG ATG dkk., 2003)
TTT CAG TTC

CCT TTC CCT CAC

23S/p10-R spacer GGT ACT G (Rachman
56 500-1200
tAla-F region dkk., 2003)
TAG CTC AGC TGG
GAG AGC
 AMPLIFIKASI GEN TARGET
Tabel 2. Komposisi PCR Mix total 10 µL

Bahan Volume (µL)

Akuades steril 2
PCR mix (2x konsentrasi) 5
Primer forward (10 pmole) 0,2
Primer reverse (10 pmole) 0,2
Sampel DNA 1
 AMPLIFIKASI GEN TARGET
Tabel 3. Reaksi siklus PCR
Primer* Reaksi PCR** Pustaka
R139-F 94 ºC-1 menit; 49 ºC-1 menit; 72 ºC- (Rachman
23S/p7-R 1 menit dkk., 2003)
(35 siklus) (Rachman
23S/p10-R 94 ºC-1 menit; 56 ºC-1 menit; 72 ºC- dkk., 2003)
tAla-F 1 menit
(35 siklus)
*F, forward; R, reverse
** denaturasi awal 94 ºC selama 5 menit dan ekstensi akhir 72 ºC selama 5 menit

Uji kualitatif Amplikon

dengan agarose 1,5 %
(0,3 g dalam 20 mL)
 ISOLASI Protein
Kultur BAL pada MRSB (15 mL) disentrifus 10.000
rpm; 4ºC; 5 min; pelet dicuci dengan akuades steril 1x
Vol kemudian disentrifus kembali dengan rpm, suhu,
dan menit yang sama

Pelet ditambah inhibitor protease (1 mM PMSF 1x vol

untuk disimpan pada suhu 4oC)

Pelet dilarutkan dengan 200 µL cell-lytic B-II bacterial

solution; divorteks sebentar; diinkubasi suhu ruang 30
min

Sampel disentrifus 10.000 rpm; 4 ºC; 5 min; supernatan

berisi protein siap digunakan analisis pita dengan SDS-
PAGE
 SDS-PAGE
Sampel protein
ditambah sampel bufer Stacking gel 3 %,
1x Vol; dipanaskan kemudian dimasukkan
suhu 100ºC 5 menit dan
pada plate; dibiarkan
didinginkan
memadat 30 menit

Separating gel 12,5 %,

kemudian dimasukkan Plate dipindah ke
dalam plate; dibiarkan chamber elektroforesis
memadat 30 menit dan diisi running bufer
pH 8,3 Tris 1,52 g; glisin
7,2 g; SDS 0,5 g;
akuabides hingga total
volume 500 mL)

Sampel 10-20 µL dimasukkan dalam sumuran

Dirunning dengan arus 20 mA; 40-50 menit
 SDS-PAGE
Gel direndam dengan larutan staining (coomassie blue
R-250 1,0 g; methanol 450 mL; akuades 450 mL; asam
asetat glacial 100 mL) sebanyak 20 mL ; 15 menit;
sambil digoyang

Gel dicuci dengan air beberapa kali

Gel direndam dengan 50 mL larutan destaining

(methanol 100 mL; asam asetat glacial 100 mL; vol
ditambah hingga satu liter); sambil digoyangs elama 30
menit; hingga pita protein tampak
 Hasil Praktikum
UJI KUANTITATF DNA

No Kode Konsentrasi DNA Kemurnian DNA

Sampel (mg/µL) (260/280)
1 R1 402,76 2,03
2 R2 1422,46 2,15
 Hasil Praktikum
Elektroforesis dna whole genome
M R1 R2

1000 bp

Gambar 4.1 Hasil elektroforesis gel agarose 0,8 % sampel DNA bakteri asam
laktat susu kuda liar : (M) marker, (R1) isolat BAL 1, (R2) isolate BAL 2
 Hasil Praktikum
amplifikasi PCR dengan primer 5,8s
K- K+ R1 R2 M

700 bp

Gambar 4.2 Hasil elektroforesis DNA amplifikasi PCR sampel DNA BAL susu kuda liar
dengan primer 5,8S: (M) marker, (R1) isolat BAL 1, (R2) isolate BAL 2, (K-) kontrol
negatif, (K+) kontrol positif
 Hasil Praktikum
amplifikasi PCR dengan primer ITS
R1 R2 M
1

800 bp
700 bp
600 bp
500 bp

Gambar 4.3 Hasil elektroforesis DNA amplifikasi PCR

sampel DNA BAL susu kuda liar dengan primer ITS: (M)
marker, (R1) isolat BAL 1, (R2) isolat BAL 2.
 Hasil Praktikum
KADAR PROTEIN

No Sampel Konsentrasi Kadar Protein

Protein (mg/ml)
1 R1 1,93 26,04
2 R2 2,01 17,19
 Hasil Praktikum
SDS-PAGE
R2 R1 M

115 kDa
110 kDa
80 kDa

55 kDa

Gambar 4.3 Hasil SDS-PAGE sampel

protein isolate BAL susu kuda liar: (M) 17 kDa
marker, (R1) isolat BAL 1, (R2) isolat
BAL 2
TERIMAKASIH