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ELISA

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)


Prueba Inmunoadsorbente
Ligado a Enzimas

Mayela López

M. Fernanda Rodríguez

Alexander Romero
ELISA
HISTORIA
 1959 Yalowy Berson, precursor de los ensayos
inmunoenzimáticos que fueron descritos
originalmente en 1971 por Engvall y Perlmann, y
Van Wemeny y Schuurs.
 El uso de material radiactivo ha limitado el uso
del radioinmunoensayo, y a la ves a popularizadp
el empleo del inmunoensayo enzimático (EIA), del
que hay dos técnicas principales:
 El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
 El ensayo inmunológico multiplicado por enzimas.
ELISA
 La prueba de ELISA se basa en la reacción
antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser
de reactividad conocida.
 El color se genera por la interacción de un
sustrato cromogénico y una enzima que ha sido
acoplada al anticuerpo detector.
 Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el
antígeno en la fase sólida, como una capa de
captura.
 Después de la reacción del antígeno con el suero
del paciente, la capa de detección puede ser un
reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM
o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos
clase específicos
ELISA

 Los métodos de ELISA dependiendo


de la actividad enzimática se
dividen en dos tipos:
 Competitivos
 No competitivos
ELISA
 ELISA COMPETITIVO:
En este método, el anticuerpo de la
muestra va a competir con el conjugado
por un número limitado de sitios de unión
del antígeno. Habrá ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el
sustrato no encontrará a la enzima
porque el conjugado ha sido desplazado
por el anticuerpo presente en la muestra.
ELISA
 ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra
con el antígeno o anticuerpo que
está en la fase sólida. Si una
muestra es positiva se formará el
complejo antígeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionará
con el respectivo sustrato
desarrollando color
ELISA

 Dentro de los no competitivos


tenemos:
 Los directos que detectan
antígenos
 Los indirectos que detectan
anticuerpos.
ELISA
 Pasos generales de un ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos
o anticuerpos
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o
antígeno tapizado en el posillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o
antígeno no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no
unida
8. Adición del sustrato
9. Unión del sustrato a la enzima
10. Desarrollo del color
ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (2)
ELISA Competitiva (3)
ELISA Competitiva (4)
ELISA Competitiva (5)
ELISA Competitiva (6)
ELISA Competitiva (7)
ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (9)
ELISA Competitiva (10)
Ejemplos
Dengue Virus

 Es un virus de ARN de cadena


simple con un diámetro de 50 nm.
 Pertenece a la familia de los
Flaviviridae
 Se distinguen cuatro grupos
serológicos:
 DEN- 1
 DEN-2
 DEN-3
 DEN-4
DENGUE...

 La infección con un serotipo no


produce inmunidad para los otros.
 El Aedes aegypti constituye el
principal vector del dengue.
Dengue...

 Imágenes clínicas:
 Periodo de incubación de 1 a 2
semanas con escalofríos.
 Dolores de cabeza
 Dolores de miembros y músculos.
Dengue...

 Dengue hemorrágico:
 Petequias
 Fuertes hemorragias nasales
 Vómito de sangre
 Melena
 Hematuria
 La agravación de la enfermedad deriva
en el Síndrome de Shock.
Utilización de la prueba

 El inmunoensayo se utiliza para la


determinación cualitativa y
semicualitativa de anticuerpos IgG
específicos contra Dengue- Virus en
suero o plasma humano.
Principio del Ensayo

 Las tiras de micropocillos (fase


sólida) están recubiertas con
antígenos específicos del Dengue-
Virus.
 Los anticuerpos presentes en la
muestra se unen a los antígenos
inmobilizados en la placa.
Principio...

 El conjugado de anticuerpos IgG


anti humano con peroxidasa del
rábano, se une a los complejos
antígeno anticuerpo en muestras
positivas.
 Después de incubarse, los
complejos muestran una coloración
azul, al incubarlos con TMB.
Principio...

 Finalmente, se añade ácido sulfúrico


para detener la reacción ( azul -
amarillo); la densidad se mide con un
lector de ELISA a 450 nm.
Procedimiento
 Repartición y Posición de las muestras.
 Se Gradúa la incubadora a 37+1 °C.
 Se pipetean 100 ul de controles y
muestras en los pocillos respectivos.
 Se recubren las tiras con los
autoadhesivos.
 Se incuba 1h + 5 min.
 Después de incubar, se retira el
autoadhesivo y se realiza el lavado.
Procedimiento...
 Pipetea 100 ul del conjugado anti IgG.
 Se incuba 30 min a temperatura
ambiente.
 Repetir el lavado.
 Se pipetea 100 ul de sustrato de TMB.
 Incuba 15 min en oscuridad a
temperatura ambiente.
 Se añade la solución de parada
 Se mide la extinción de la solución con
450/620nm por 30 min.
ETI- LKM1 y ETI mitocondrial

 Permite la determiación cualitativa


de autoanticuerpos dirigidos contra
el citocromo P450 (LKM1) y las
enzimas mitocondriales (M2A/M2C)
en suero humano.
Principio del Ensayo
 Los pocillos de la microplaca se
recubren con los antígenos.
 Al añadir las muestras, , el anticuerpo
se une a los pocillos recubiertos.
 En estos se incub IgG conjugada con
la enzima peroxidasa del rábano
contra IgG humano.
 Se añada cromógeno y se lee con el
espectrofotómetro.
¡MUCHAS GRACIAS!

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