CLASE 12: LA REPLICACION DEL DNA

LA REPLICACION ES SEMI-CONSERVATIVA
Que el proceso de replicación sea semi-conservativo
significa que cada una de las hebras parentales sirve
como molde para la síntesis de su hebra hija
complementaria. Esto fue determinado mediante el
experimento de Meselson y Sthal en 1957, 17 años
después del descubrimiento de la estructura de la
doble hélice del DNA.
En este experimento, la bacteria E. coli fue cultivada
varias generaciones en NH4Cl (15N) como única
fuente de nitrógeno. Luego, se cultivaron las
bacterias con NH4Cl (14N). Se extrajo el DNA y se
analizó su migración en un gradiente de CsCl en
después de cada generación. Del cultivo original se
obtuvo DNA pesado (el N15 es 1% más pesado que
el N14) y después de la primera generación con N14
se obtuvo un híbrido de DNA pesado y liviano. De
la segunda generación se obtuvo DNA híbrido
pesado y DNA liviano. Esto sólo puede explicarse
si la hebras parentales generan cada una de manera
de manera independiente las hebras hijas en cada
generación.
Isótopos del nitrógeno
 LA REPLICACION ES SIMULTANEA EN
AMBAS HEBRAS

Imagen por auto-

radiografía (hebra
radiactiva en rojo)

Estructura tipo theta

Imagen al
microscopio
electrónico

Que la replicación de las dos hebras del DNA es simultánea significa que cada una de las
hebras es copiada al mismo tiempo y no una primero y la otra después. Esto fue
demostrada con el experimento de Cairns para lo cual se cultivó E. coli con timidina
tritiada (3H) por largo tiempo y luego el cromosoma circular fue visualizado por
autoradiografía. Se observó que al comienzo se forma un ojo replicativo con una
estructura tipo theta marcada radiactivamente lo que indica que ambas hebras hijas están
siendo copiadas simultáneamente.
 Isótopos del hidrógeno

El protón (H) es la especie más abundante

El deuterio (D) es una especie pesada del hidrógeno no radiactiva
El tritio (T) es una especie pesada del hidrógeno que emite radiación beta
 LA REPLICACION ES BIDIRECCIONAL

Imagen por autoradiografía

(hebra radioactiva en rojo)

En el experimento de Cairns también se cultivó E. coli con timidina tritiada por

corto tiempo. En este caso, la autoradiografía mostró que ambos extremos del ojo
replicativo (estructura tipo theta) estaban marcados radioactivamente lo que indica
que ambos extremos están siendo replicados de manera simultánea y bidireccional.
En el ojo replicativo o estructura tipo theta existen por lo tanto dos horquillas
replicativas.
 LAS DNA POLIMERASAS Y EL REQUERIMIENTO
DE PARTIDOR INICIADOR

Las DNA polimerasas de procariontes y eucariontes requieren de un pequeño

oligonucleótido como partidor iniciador de la replicación que provea un extremo 3´OH
libre donde se unirá el siguiente desoxinucleótido. Las DNA polimerasas son diferentes
a las RNA polimerasas en que estas últimas pueden unir el nucleótido iniciador en su
centro activo y no requieren de un partidor iniciador. Todas las DNA polimerasas tienen
forma de mano empuñada y en la palma de la mano ocurre el proceso de polimerización
en el cual la hebra molde es copiada en una hebra complementaria.
 LA REPLICACION ES SEMI-DISCONTINUA EN LA
HORQUILLA

Debido al requerimiento de partidor iniciador por parte de las DNA polimerasas, la hebra
3´-5´es de la horquilla replicativa es sintetizada a partir de un sólo partidor en el sentido
5´-3´ y por lo tanto su síntesis es rápida (hebra líder o leading strand). Por el contrario, la
hebra antiparalela 5´-3, requiere de múltiples partidores que son sintetizados a medida
que se abre y avanza la horquilla replicativa por lo que la síntesis de esta hebra es más
lenta (hebra retardada o lagging strand). Las múltiples hebras lagging sintetizadas
corresponden a los fragmentos de Okazaki. Lo que ocurre en una horquilla replicativa
está ocurriendo de manera simultánea en la otra horquilla replicativa.
 VELOCIDAD Y PROCESIVIDAD DE LAS DNA
POLIMERASAS

Las células procariontes y eucariontes tiene varias DNA polimerasas. Por ej. en E. coli
existen tres DNA polimerasas, la DNA polimerasa I, II y III. Estas enzimas tienen
distinta velocidad de polimerización que puede ser de 20 a 1000 nucleótidos por
segundo y una distinta procesividad (capacidad de mantenerse unida a la hebra de DNA
molde simple hebra) que es de 3 a 500.000 nucleótidos adicionados antes de disociarse.
En E. coli, la DNA polimerasa que realiza la síntesis de la hebra leader y lagging es la
DNA polimerasa III que tiene mayor velocidad y procesividad.
CAPACIDAD CORRECTORA DE LAS
DNA POLIMERASAS
A veces las DNA polimerasas
son “engañadas” por las formas
tautoméricas de los nucleótidos
por lo que incorporan
nucleótidos equivocados.
Las DNA polimerasas tienen un
dominio catalítico donde se
(continúa) realiza la polimerización y otro
que tiene actividad correctora
(actividad exonucleasa 3´-5´).
El fragmento Klenow de E. coli
corresponde a la DNApol I
proteolizada que solo mantiene
actividad polimerizante, pero no
correctora.
La mayoría de las DNA
polimerasas tienen una fidelidad
de 1 error en 106 a 108 pb.
 DNApol I y DNA ligasa

Los fragmentos de Okazaki en la hebra lagging no quedan unidos unos con otros tras ser polimerizados, quedan
nicks entre fragmentos luego de que se remueve el primer de RNA y se sustituye con DNA gracias a la actividad
exonucleasa 5’->3’ y la actividad polimerizante de la DNA polimerasa I.
Estos nicks son unidos por la enzima DNA ligasa mediante gasto de ATP.
La DNA pol II tiene actividad correctora (exonucleasa 3’->5’) y polimerizante que ayuda a la corrección de errores en
la doble hebra.
La DNA pol III sintetiza las hebras leader y lagging.
 EL ORIGEN DE REPLICACION (Ori C) Y LOS
TERMINADORES EN E. coli

La replicación en E. coli depende de un sólo origen de replicación denominado Ori C

y de varios terminadores ubicados en cada una de las dos hebras. La replicación de
cada hebra termina cuando cada una de las hebras sintetizadas coinciden y chocan.
LA ESTRUCTURA DEL ORIGEN DE REPLICACION
DE E. coli

El origen de replicación Ori C de E. coli está compuesto por 245 pb y

consta de tres regiones de 13 pb contiguas y de 4 regiones de 8 pb que están
separadas.
 LA MAQUINARIA DE
REPLICACION EN E. COLI
En primer lugar, se unen 20 proteínas DnaA con
requerimiento de ATP en las cuatro secuencias de 9
pb del Ori C.
Después, es une una proteína HU (tipo histona) con
requerimento de ATP a la base del complejo
anterior.
Luego, se une la proteína DnaC a las secuencias de
13 pb la cual permite que se una DnaB que tiene
actividad helicasa y que abre las hebras de DNA en
el sitio de inicio de la replicación.
Cuando las hebras están abiertas se unen de manera
cooperativa las proteínas SSB (Single Strand
Binding proteins) a cada una de las hebras abiertas
y luego la DNA topoisomerasa II que relaja la
tensión generada por la helicasa estabilizando así
el complejo abierto.
Sólo entonces se recluta la enzima Primasa
formando el complejo primosoma que sintetiza el
partidor de la hebra leader y los partidores de la
hebra lagging.
LA SINTESIS DE LOS PARTIDORES DE LA
REPLICACION EN E. COLI

En E. coli los partidores de la DNA

polimerasa III son oligoribonucleótidos
de 10 bases los cuales son sintetizados
por un complejo proteico denominado
primosoma en el cual la enzima principal
es una DNA primasa (DnaG) y una
helicasa (DnaB). La DNA primasa es
una RNA polimerasa que utiliza
ribonucleótidos para la síntesis de
partidores y como todas las RNA
polimerasa es capaz de unir el
ribonucleótido iniciador. Esta enzima
sintetiza un partidor RNA en la hebra
leader y múltiples partidores en la hebra
lagging, cada 100 a 200 nucleótidos.
 Las Topoisomerasas

La Topoisomerasa de tipo I hace un nick en una de las hebras del DNA, pasa la hebra intacta por la apertura y
luego cierra la hebra abierta.
La Topoisomerasa de tipo II corta ambas hebras del DNA, permitiendo el paso de una doble hebra completa
por la apertura y finalmente une los extremos como eran originalmente.
 LA DNA POLIMERASA III SINTETIZA AMBAS
HEBRAS EN E. coli

La DNA polimerasa III actúa como dímero para la síntesis simultánea de ambas hebras. El core
enzima que tiene la actividad polimerizante está compuesto por las subunidades α, ε y θ. Las dos
unidades de core enzima αεθ se unen mediante un dímero de la subunidad τ (tau). La subunidad τ
se asocia entonces con el complejo de subunidades γ2δδ´ψχ o clamp loading complex. El complejo
(αεθ)2- τ2- γ2δδ´ψχ (14 polipéptidos) corresponde a la DNA polimerasa III. Para que la DNA
polimerasa III tenga alta procesividad se requiere de 2 subunidades β asociadas a cada core
enzima.
LAS CINCO DNA POLIMERASAS DE EUCARIONTES

PM (kDa)
300

40
300

200
250

La afidicolina es capaz de inhibir las

DNApol de tipo α, δ y ε
Detiene el ciclo celular en la fase S
 La horquilla de replicación en eucariontes

EL factor PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) asociado a las DNApol δ y ε permite
aumentar la procesividad de las polimerasas.
El factor PCNA también se conoce como DNA clamp o sliding clamp. Rodea como una
argolla al DNA y actúa como andamio para otras proteínas como las polimerasas y las
topoisomerasas.
 Modelo del core enzimático de replicación de DNA en eucariontes

El complejo RFC (Replication Factor C) compuesto por 5 subunidades permite el anclaje de PCNA al DNA.
El complejo GINS (proteínas “Go-Ichi-Ni-San” 5-1-2-3) es indispensable para la iniciación y elongación
durante la replicación.
Las proteínas SSB en eucariontes también se conocen como RPA.
El complejo MCM (MiniChromosome Manteinance) posee 6 proteínas y actúa como helicasa.
La proteina Fen1 (Flap endonuclease 1) remueve los extremos colgantes (“flap”) de los Okazaki
LOS ORIGENES DE REPLICACION EN
EUCARIONTES

Los cromosomas en eucariontes tienen

múltiples orígenes de replicación que
están separados por 30.000 a 300.000 pb.

Los orígenes de replicación en eucariontes

tiene aprox. 300 pb y las proteínas que se
unen a ellos no se conocen con exactitud.

En levadura (16 cromosomas) existen

alredor de 400 orígenes de replicación
denominados ARS (Autonomously
Replicating Sequences).

En un determinado cromosoma no todos

los orígenes de replicación son utilizados
al mismo tiempo, unos lo hacen primero y
otros más tardiamente.