METODOS DE INCLUSION DE PARAFINA:

DESHIDRATACION, DESALCOHOLIZACION,
EMBEBIDO, BLOQUE DE PARAFINA.
METODO DE INCLUSION EN METACRILATO,
MICROTOMO. TIPOS DE MICROTOMO.
MICROTOMO DE ROTACION. CRIOSTATO.
NAVAJAS. TIPOS, CUIDADOS Y AFILADO.

• GALLEGOS PALERMO, CHRISTIAN.

• MENDOZA EUGENIO, YSABEL ELISA.
• MEZA PAGANO, LUIS WILREDO.
 INCLUSIÓN
 Una vez fijado la muestra, se tiene dos métodos para endurecer el tejido
para su corte.
1. La congelación: previamente fijados los tejidos permite la obtención de
secciones que pueden ir desde unas 50 µm hasta decenas de µm de
grosor.
 Micrótomo de congelación para secciones de decenas de µm,
 Criostato para secciones de entre 5 y 20 µm y
 Ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm.
 Sacarosa al 30 %, glicerol, etc.
 INCLUSIÓN
2. La inclusión: es el método más
común de endurecer el tejido y
consiste en infiltrar la muestra
con sustancias líquidas que
tras un proceso de
polimerización o enfriamiento
se solidifican, sin afectar a las
características del tejido.
 DESHIDRATACIÓN
Se coloca la muestra en alcoholes
de concentración creciente para eliminar el
agua que contenga ya que la parafina no es
miscible con agua. Se utiliza etanol 70%, 80%,
96% y 100%.
Los tejidos contienen grandes cantidades de
agua que debe ser eliminada y reemplazada por
parafina.
El volumen de alcohol debe ser
aproximadamente 10 veces el volumen del tejido
a deshidratar.
 ESQUEMA CORTO DE DESHIDRATACIÓN PARA BIOPSIAS Y
FRAGMENTOS PEQUEÑOS DE TEJIDOS
Tiempo total de procesamiento 3 – 4 horas
 Enjuague muy brevemente la muestra de tejido en agua corriente.
 Colocar la muestra de tejido en alcohol al 80%.
 Someter la muestra de tejido a alcohol al 95% realizándose 3 cambios de 15 minutos
cada uno.
 Someter la muestra de tejido a alcohol absoluto, se realizarán 3 cambios de 15
minutos cada uno.
 Colocación de la muestra a partes iguales de alcohol absoluto y xilol 15 minutos.
 Colocación de la muestra en Xilol realizando 2 cambios de 15 minutos cada uno.
 Colocación en parafina realizándose 3 cambios de 15 minutos cada uno.
 Incluir la muestra de tejido.
 PROCESO MANUAL PARA DESHIDRATAR ESPECÍMENES
GENERALES
 Enjuague brevemente la muestra en agua corriente.
 Se realizarán 5 cambios de alcohol de 45 minutos cada uno. Si el
espécimen o muestra de tejido es grande 60 minutos cada uno. 80%,
90%, 95% y 99%.
 1 cambio de xilol-alcohol de 45 minutos. Si la muestra es grande 60
minutos.
 2 cambios de xilol de 45 minutos cada uno. Si es grande el espécimen 60
minutos cada uno.
 3 cambios de parafina de 45 minutos cada uno. Si es grande la muestra
60 minutos cada uno.
 ACLARAMIENTO: (DIAFANIZACIÓN, DESALCOHOLIZACIÓN)

 Permite que el alcohol de los tejidos sea

reemplazado por un líquido que disuelva la
parafina con la cual el tejido va a ser
impregnado. El solvente de parafina más
usado es el Xilol.
 Cuando la deshidratación no es completa, el
xilol toma un aspecto lechoso cuando se le
añade el tejido.
 Otros agentes aclarantes son: Tolueno,
Cloroformo, Aceite de cedro, entre otros.
 INCLUSIÓN (EMBEBIDO, IMPREGNACIÓN)

 Comprende la impregnación de los tejidos con

un medio que llene todas las cavidades
naturales, y que proporcione la consistencia
firme necesaria para hacer cortes bien
delgados sin provocar distorsión.
 Un sustituto de la parafina es el Paraplast®
(combinación de parafina con polímeros
plásticos).
 El volumen del medio de impregnación debe
ser aproximadamente 25 veces mayor que el
volumen del tejido.
 ESQUEMAS DE TIEMPO PARA LA
DESHIDRATACION, ACLARAMIENTO E
INCLUSION EN PARAFINA
• Alcohol etílico corriente 1 hora • Alcohol etílico corriente 45 a 60 minutos
• Alcohol etílico corriente 1 hora • Alcohol etílico corriente 45 a 60 minutos
• Alcohol etílico corriente 1 hora • Alcohol etílico corriente 45 a 60 minutos
• Alcohol etílico absoluto 1 hora • Alcohol etílico absoluto 45 a 60 minutos
• Alcohol etílico absoluto 1 hora • Alcohol etílico absoluto 45 a 60 minutos
• Alcohol etílico absoluto 1 hora • Alcohol etílico absoluto 45 a 60 minutos
• Xilol 1 hora • Xilol 45 a 60 minutos
• Xilol 1 hora • Xilol 45 a 60 minutos
• Xilol 1 hora
• Parafina 45 a 60 minutos
• Parafina 1 hora
• Parafina 45 a 60 minutos
• Parafina 2 horas
 MOLDES PARA BLOQUES

a) "L" de inclusión: Consiste en dos piezas en

forma de L de material pesado tipo bronce,
que descansan sobre una base metálica plana.
b) Moldes plásticos para inclusión: Consiste en
una base de plástico o de acero inoxidable
dentro de la cual se incluye la pieza tisular.
c) Centro de Inclusión: Son unidades
multifuncionales usualmente equipadas con
dispensador de parafina.
 TÉCNICA

a) Se recomienda un punto de fusión para la parafina entre 54 y 58°

C.
b) Mantener la parafina líquida en el recipiente final de parafina del
procesador automático, el cual se pasa a la mesa de trabajo.
c) Se coge una cápsula metálica que contiene el tejido procesado. Se
extrae el tejido de la cápsula y se coloca en el molde para hacer
bloques llenos con parafina derretida. La cara del tejido donde se
quieren hacer los cortes se coloca hacia abajo, y los tejidos deben
orientarse cuidadosamente para que el plano de corte sea el
deseado.
 TÉCNICA

d) Una vez que los tejidos han sido incluidos así, y en cuanto la
parafina se solidificó en parte, los moldes se colocan en un
recipiente con hielo por 30 minutos o toda la noche, lo cual
reduce la tendencia de algunas parafinas a cristalizarse y
permite obtener bloques de consistencia firme y uniforme.
e) Retirar el molde, quedando el bloque de tejido parafinizado
listo para cortar.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO

Para estudio de biopsias óseas no

descalificadas, que permita realizar
cortes de 3-5 µm de grosor de
muestras, mediante un
equipamiento relativamente
convencional en el que no se
incluyen sierras de precisión ni
sofisticados equipos de desbastado y
micropulido.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO

Permite mantener intacta la fase mineral del

hueso; y esta característica, aunque de gran
importancia, Otras ventajas:
a) Tinción específica de las líneas cementantes y
del osteoide.
b) Persistencia de los fluorocromos (tetraciclinas,
azul de calceína, naranja de xilenol, etc.)
administrados in vivo.
c) Localización histoquímica de ciertos enzimas
y diversas sustancias.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: TÉCNICA

El procesado de muestras óseas no descalcificadas requiere

una serie de pasos generales que son comunes a otras técnicas
histológicas, aunque presentan, en algunos casos, grandes
diferencias:
1. Obtención de la muestra: Permite el procesado de
muestras de gran tamaño, se aconsejan biopsias de
morfología cúbica con un tamaño no superior a 1 cm de
lado si la muestra va a ser seccionada mediante
micrótomo.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: TÉCNICA

2. Fijación: Realizarse lo más rápidamente

posible y consiste en la inmersión en alcohol
etílico 40%. Tanto la fijación como los
siguientes pasos de deshidratación e
infiltración deben realizarse a 4 ºC.
3. Deshidratación: Se realiza en series de alcohol
etílico de gradación creciente.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: TÉCNICA

Procedimiento: Deshidratación.
• Alcohol etílico 70%, 2 baños de 1-2 días.
• Alcohol etílico 95%, 3 baños de 2 días.
• Alcohol etílico absoluto, 1 día.
• Alcohol etílico absoluto, 2 baños de 1 día.
• Xileno, 2 baños de 1 día.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: TÉCNICA

4. Infiltración: Consiste en sumergir las

muestras en soluciones de MMA (monómero),
dibutil-ftalato (plastificador) y
concentraciones crecientes de peróxido de
benzoilo (iniciador) hasta una solución final
idéntica a la solución de polimerización.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: TÉCNICA

5. Desestabilización del MMA: se encuentra estabilizado con 10 ppm de

hidroquinona-monometil-éter: Procedimiento:
a) Se lava el monómero estabilizado con hidróxido sódico 5% (p/v) en un
embudo de decantación, se agita fuertemente, se deja reposar y se elimina
la fracción oscura.
b) El siguiente paso consiste en eliminar los restos de hidróxido sódico, para
ello se lava en 100 ml de H20, se agita y se elimina el efluente; repitiendo
la operación 4-5 veces hasta que el efluente muestre un pH neutro.
c) Posteriormente se deseca el monómero filtrándolo a través de cloruro
cálcico.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: TÉCNICA

Preparación de las soluciones de infiltración:

Solución I (3)
 75 ml de metilmetacrilato.
 25 ml de dibutilftalato.
 0,5 ml de a-terpineno al 1% en MMA.
Solución III (6)
 75 ml de metilmetacrilato.
 2,5 g de peróxido de benzoílo.
 25 ml de dibutilftalato.
 0,5 ml de a-terpineno al 1% en MMA.
Solución II (4)
 75 ml de metilmetacrilato.
 1 g de peróxido de benzoilo.
 25 ml de dibutilftalato.
 0,5 ml de a-terpineno al 1% en MMA.
La infiltración debe llevarse a cabo a 4 oC y
es conveniente mantener una presión de 22
mm Hg en el interior del vial mediante la
utilización de una bomba de vacío.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: TÉCNICA

6) Polimerización: Series inconvenientes. Protocolo.

• Previamente se prepara una capa polimerizada en el fondo de un vial de
boca ancha de 30 ml vertiendo 5 ml de Solución III recién preparada.
• Se tapa herméticamente para evitar que el 02 inhiba la polimerización, y
se mantiene a temperatura ambiente durante una noche.
• A continuación, se coloca el vial en un baño termostatado de agua a 38 °C,
produciéndose la polimerización en 1-3 días.
• Posteriormente se coloca la muestra previamente infiltrada sobre la capa
prepolimerizada del vial, se orienta de manera adecuada y se rellena el
molde casi completamente con Solución III reciente. Se cierra y se
mantiene a temperatura ambiente durante una noche.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: TÉCNICA

• Transcurrido este tiempo se coloca el vial en un baño termostatado de

agua a 38 °C.
• La polimerización suele tener lugar a los 2-3 días. La muestra una vez
incluida se puede almacenar a temperatura ambiente durante mucho
tiempo, pero si el espécimen ha sido tratado con diversos fluorocromos
(tetraciclinas, verde de calceína, naranja de xilenol, etc.) hay que evitar
que sea iluminado de forma directa.
• Se aconseja la utilización de envases de vidrio de boca ancha, ya que
durante la polimerización se producen corrientes de convección en el
medio de inclusión debido al calor generado y este mayor diámetro
facilita que se disipe
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: pasos.

• Primero se elimina el monómero comercial que tiene un antioxígeno

estabilizador que impide su polimeración.
• Para ello se debe eliminarse este compuesto lo cual se consigue lavando el
monómero con una solución de sosa al 20 por 100 y cambiándolo varias
veces.
• Posteriormente se lava con agua destilada hasta conseguir neutralizar.
• Luego se deseca con silicagel.
• Seguidamente se procede a la preinclusión de la muestra después de
tratarla con acetona absoluta anhidra, después se la somete a una mezcla
de acetona y monómero, a partes iguales.
 METODO DE INCLUSION EN METACRILATO: pasos.

• Finalmente se coloca en dos baños de monómero puro. La permanencia

en cada baño es de una hora. Se mejora considerablemente la penetración
del compuesto en la muestra haciendo la preinclusión a bajo vacío y a
baja temperatura.
• Se colocan las muestras así embebidas en pequeñas capsulas de gelatina
que se llenan de monómero y posteriormente se procede a la
polimerización, añadiendo al monómero un 1 por 100 de peróxido de
benzoilo o sometiéndolo a la acción de los rayos ultravioletas. En el
primer caso se coloca a 45 ºC, en segundo caso se puede trabajar a
temperatura ambiente o a 4 ºC. El tiempo de polimerización es unas 12
horas.
 MICROTOMO

• Son aparatos mecánicos para hacer

secciones de un grosor de
micrómetros, existen diferentes
tipos según el grosor que queramos
conseguir en nuestras secciones,
según el medio de inclusión en el
que se encuentre el tejido y según el
proceso de endurecimiento de la
muestra: por congelación o por
inclusión.
 MICROTOMOS PARA PARAFINA

• Rotatorio: El más usado, donde el

bloque se mueve. La cuchilla se
ubica con el filo hacia arriba.
La principal ventaja: es su precisión,
la posibilidad de obtener secciones
seriadas con facilidad y la
automatización del proceso de corte
mediante motores eléctricos.
 MICROTOMOS PARA PARAFINA

• De deslizamiento: El más usado,

donde el bloque se mueve. La
cuchilla se ubica con el filo hacia
arriba.
Las principales ventajas del
micrótomo de deslizamiento son más
sencillos mecánicamente y su
disposición permite cortar bloques
más grandes, o bloques de celoidina,
aunque están cayendo en desuso.
 MICROTOMOS:

• Micrótomo manual. Es un
dispositivo muy sencillo que consta
de un soporte para sujetar la
muestra. Los cortes se realizan a
mano con una cuchilla. Este
micrótomo se usa prácticamente
sólo para tejidos vegetales, Hace
cortes gruesos, 100 µm o más,
observables con el microscopio
óptico.
 MICROTOMOS:

• Criostato: Consigue
secciones a partir de
material congelado y se
obtienen grosores de 10
a 40 µm, para observar
con el microscopio
óptico.
El compartimento de color azul es la cámara refrigerada
a la temperatura seleccionada. En esta cámara se
encuentra la muestra, la cuchilla y es donde se recogen las
secciones.
 MICROTOMOS:

• Vibratomo. Corta
material no incluido,
aunque sí fijado o duro,
en secciones que pueden
ir desde 30 hasta
centenares de µm de
grosor. Estas secciones La cubeta, de color negro, ha de estar llena de
se observan con el tampón de trabajo durante el proceso de corte
microscopio óptico. de manera que la cuchilla y la muestra, de
color rojo, y las secciones que se obtienen
están sumergidos.
 MICROTOMOS:

• Micrótomo de
congelación. Con él se
consiguen secciones de
30 a unas 100 µm de
grosor a partir de
El tubo negro de la derecha es el encargado de
material congelado y se
observan con el enfriar el portabloques a temperaturas
microscopio óptico. inferiores a -20 °C, lo cual congela a su vez a
la muestra (color rojo). Las secciones se
recogen de la cuchilla con un pincel y se
colocan en tampón de trabajo.
 MICROTOMOS:

• Ultramicrótomo. Con él se corta material

incluido en resinas y se obtienen secciones
habitualmente de unas pocas decenas de
nanómetros de grosor, pero también entre
0.5 y 1 µm. Las secciones de 0.5 µm o más
se observan con el microscopio óptico,
mientras que las de un grosor de decenas
de nanómetros van destinadas a ser
observadas con el microscopio electrónico
de transmisión.
 CUCHILLAS DE MICROTOMOS

• Cuchillas de acero inoxidable: Para cortar parafina. La

longitud de las cuchillas varía de 110 mm a 250 mm.
• Descartables: Excelentes para cortes en parafina. Existen
disponibles en diversos tamaños y grosores. El porta cuchillas
descartables debe mantenerse limpio y bien lubricado, para
que la cuchilla esté segura.
• Diamante o vidrio: Para especímenes incluidos en resinas, pues
tienen filos más gruesos.
 CUCHILLAS DE MICROTOMOS

Se clasifican de la forma siguiente:

1. Plano-cóncava: una cara es plana y la otra cóncava.
2. Semicóncava-plana: una cara es algo cóncava y la otra plana.
3. Plano-plano: ambas caras son planas.
4. Bicóncava: ambas caras son cóncavas.
 AFILADO DE CUCHILLAS

• A mano: Se hace utilizando una de éstas dos formas:

 Con piedra de afilar: Es una piedra natural o superficie dura
para afilar un cuchillo u otro instrumento cortante. Utilizan
aceite como lubricante.
 Con placa de vidrio: Se usa con polvo abrasivo.

• Afiladores automáticos: Este equipo ahorra mucho tiempo y

esfuerzo en el afilado de las cuchillas.