Sondas en la

identificación de la
individualidad
inmunológica en
Leishmaniasis

Felix J. Tapia
Instituto de Biomedicina
Facultad de Medicina
Universidad Central de Venezuela

XVIII Congreso Venezolano de

Microscopia y Microanálisis (CONVEMI),
Cumaná 17 al 19 de octubre 2018
 Red inmunológica

bazo
timo
médula
ósea

sangre

SALT MALT

organo linfoide
secundario
Respuesta inmunológica en el tiempo
 Sistema Inmunitario Cutáneo

CL

QC epidermis

T
Mc
unidad Mc
perivascular
dérmica QC

infiltrado
Coinfección Leishmaniasis y VIH
 Clasificación del Género Leishmania
Género
Leishmania

SubGénero Leishmania (L.) Viannia (V.)

Complejo
donovani tropica mexicana hertigi braziliensis

Especie
L.(L.) donovani L.(L.) tropica L.(L.) mexicana L.(L.) hertigi L.(V.) braziliensis
L.(L.) infantum L.(L.) aethiopica L.(L.) amazonensis L.(L.) deani L.(V.) peruviana
L.(L.) chagasi L.(L.) major L.(L.) pifanoi L.(V.) panamensis
L.(L.) archibaldi L.(L.) gerbilli L.(L.) garhami L.(V.) guyanensis
L.(L.) venezuelensis L.(V.) lainsoni
L.(L.) aristidesi L.(V.) naiffi
L.(L.) enrietti L.(V.) shawi
L.(V.) equatorensis
L.(V.) colombiensis

Mendoza, Shaw, Tapia, 1986

 Leishmaniasis Tegumentaria

LCL LCD

C57BL/6 BALB/c
IFN- IL-4
DBA
IFN / IL-4

Formas Intermedias

LCM LCI
 Modelo múrido de Leishmaniasis Cutánea Americana

L. mexicana
MHOM/BZ/82/BEL21
C57BL/6 BALB/c

Th1 Th2
IFN- IL-4

Sánchez et al. Acta Micros 1993, 2: 180-187

Aguilar-Torrentera et al. Am J Trop Med Hyg 2002, 66: 273–279
Díaz et al. Clin Exp Dermatol 2003, 28: 288-293
 Fases de la Regulación Cutánea

Activación Inmunoestimulación Fase Efectora

Desafío Presentación de antígeno Retención

Captura de antígeno Expansión clonal Proliferación
Migración Reclutamiento Supresión

Tapia, Fermín, Corado, 2000

 Fases de la Regulación Cutánea

Activación Inmunoestimulación Fase Efectora

Desafío Presentación de antígeno Retención

Captura de antígeno Expansión clonal Proliferación
Migración Reclutamiento Supresión

Tapia, Fermín, Corado, 2000

El péptido antimicrobiano LL-37 y su
efecto en leishmaniasis
• Péptido antimicrobiano LL-37

Superficie

Birgitta Agerberth Gudmundur H. Gudmundsson

Queratinocitos
 El LL-37 también tiene actividad quimiotáctica por
el receptor FPRL-1 (formyl peptide receptor like 1) (de
Yang y col., 2000).
Neutrófilos
 Induce quimiocinas inflamatorias y sus receptores
en monocitos y células epiteliales (Scott y col., 2002).

 Aumenta la endocitosis e induce la activación de

Mastocitos
CDs (Davidson y col., 2004).

 Inhibe la RI inducida por LPS y por IFN (Cirioni y

col., 2006; Nijnik y col., 2009).
Expresión de LL-37 en pacientes con LCL

Nilka L. Díaz
 Efectos del péptido antimicrobiano LL-37 sobre L. mexicana
A

A
100

80
Viabilitdad (%)

*
60

40

20 *

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
LL-37(mM)
B
B

100 LL-37 2mM

LL-37 12 mM (LD50)
Viabilidad (%)

80
LL-37 20mM
60

40

20

0 30 60 90 120
Tiempo (min) A) Promastigotes L. mexicana sin tratamiento.
B) Promastigotes L. mexicana + LL-37 12 mM
A) Viabilidad de los promastigotes después de 16h
B) Cinética del efecto leishmanicida

Nilka L. Díaz
 Control LL-37 5µM

acidocalcisomas
mitocondria
flagelo
núcleo

LL-37 10µM LL-37 20µM

Barra: 1μm Nilka L. Díaz – Héctor Finol

Efectos del péptido antimicrobiano LL-37 sobre la proliferación
Control de fluorescencia Sin estímulo LL-37 2 µM
Células esplénicas
CFSE
+ estímulo

Proliferación

Antígeno de L. mexicana Antígeno + LL-37 1 µM Antígeno + LL-37 2 µM Antígeno + LL-37 5 µM

70 *
* Sin estímulo
proliferación (%)

LL-37 2mM
50 Antígeno
Ag+ LL-37 1mM
30 Ag+LL-37 2mM
Ag+LL37 5mM

10

Sin estímulo
LL-37 2uM
AntígenoAg+ LL-37
Ag+LL-37
1uM Ag+LL37
2uM 5uM
Nilka L. Díaz
Nijnik y col., 2009. LL-37 inhibe la proliferación de células esplénicase+ LPS y efectos de IFN- en CPA
 Péptido antimicrobiano LL-37 - Sumario

• Los resultados indican que el péptido antimicrobiano

LL-37 tiene actividad leishmanicida a altas
concentraciones y actividad inmuno-reguladora a
bajas concentraciones.

• Esta acción induce aumento en la captura del

parásito por macrófagos y células dendríticas

• Además induce un aumento en la proliferación

leucocitaria frente a antígenos del parásito.
 Fases de la Regulación Cutánea

Activación Inmunoestimulación Fase Efectora

Desafío Presentación de antígeno Retención

Captura de antígeno Expansión clonal Proliferación
Migración Reclutamiento Supresión

Tapia, Fermín, Corado, 2000

Células Dendríticas
 Células Dendríticas CD205+ en epidermis múrida

Células Dendríticas CD1a+ en epidermis humana Célula Dendrítica CD1a y Linfocitos T CD4+
 epitelio
sangre

Célula
Precursora
Las células de Langerhans son el prototipo
clásico de células dendríticas
CD inmaduras

linfático
CD maduras

ganglio linfático
Subtipos y Funciones de Células Dendríticas
 Linaje de las Células Dendríticas
Célula Madre
CD34+
Médula ósea

Precursor Precursor
linfoide mieloide

B
monocito granulocito
CD14+ CD

NK Célula de Célula Dendrítica

Langerhans Convencional

CD
CD

Célula Dendrítica
T Plasmacitoide Célula Dendrítica
Intersticial
 epitelio
sangre

Célula
Precursora

Transferencia de antígenos
en órganos linfoides secundarios
CD inmaduras

CD plasmocitoides linfático
CD maduras

ganglio linfático
Densidad de Células Dendríticas que expresan CD1a, CD83 y
IL-10 en lesiones de leishmaniaisis cutánea americana

750
LCL
células/mm2

ICL
500 DCL

250

0
CD1a CD83 IL-10
Díaz et al., 2002
 Citocinas en LCL

IL-10 LCI

IFN- LCI
 Factores de Transcripción que regulan la
diferenciación de linfocitos T

IL-21
IL-17ª IFNɣ
IL-17f IL-2
IL-22
Th17 Th1 Ltα
(IL-10) (IL-10)

RORɣt/Stat3 T-bet/Stat4
T
virgen
CD4
FoxP3/Stat5 Gata3/Stat5
IL-4
TGFβ IL-5
IL-35 iTreg
IL-10
Th2 IL-13
IL-25
Amfiregulina
IL-10
 Factores de transcripción en linfocitos T de pacientes LMC
relacionados con la activación de subtipos de CDs de
sangre periférica

A) CDs Mieloides B) CDs Plasmocitoides

120 120
100 100
% Pacientes

% Pacientes
80 T-bet 80 T-bet
60 GATA-3 60 GATA-3

40 FOXP-3 FOXP-3
40
ROR-gt ROR-gt
20 20
0 0
CDsM CD83+ CDsM CD83- CDsP CD83+ CDsP CD83-

T-bet > Th1

Gata3 > Th2 Orquídea L. Rodríguez
FoxP3 > Treg
ROR gt > Th17
 Análisis multivariado en sangre de LMC

LCA
Correlación entre la maduración y activación de CDsM
y CDsP y los factores de transcripción en linfocitos T
4,8
•CDsM CD83+ con FOXP-3, GATA-3 y ROR-t
•CDsP CD86 +correlaciona + con T-bet
4,0

3,2
linf-Tbet

CD3-Tbet
CD4-Tbet
Component 2

2,4

1,6
CS

CD123_CD86
0,8

linf-FOXP3
CD11cCD83
CD3-GATA3
LCA linf-GATA3
-1,6 LCA 1,6 CD4-FOXP3 3,2 4,8 6,4 8,0 9,6 11,2
CE CD3-FOXP3
LCA
CS CE CD3-ROR
CD4-ROR LCA
CS -0,8 linf-ROR
CD123CD83 CD4_GATA3
CS CE
T-bet > Th1
CS CD11c_CD86
CS
-1,6
Gata3 > Th2
FoxP3 > Treg
ROR gt > Th17
Component 1
 Fases de la Regulación Cutánea

Activación Inmunoestimulación Fase Efectora

Desafío Presentación de antígeno Retención

Captura de antígeno Expansión clonal Proliferación
Migración Reclutamiento Supresión
Modelo de estrés agudo
 Progresión de la infección por L. (L.) mexicana
en ratones BALB/c y C57BL/6 sometidos a estrés agudo

6 2hr stress & infect

6 8hr stress & infect
footpad thickness (mm)

infect without stress

5 2hr stress & healthy
5

4 4

3 3

2
2

1
Progresión de la infección por L. (L.) mexicana
en ratones BALB/c sometidos a estrés agudo
 Densidad de células de Langerhans en grupos
experimentales de BALB/c y C57BL/6

2hr estrés sanos

1000 2hr estrés infectados
2000
8hr estrés infectados
Sin estrés infectados
750
cells/mm 2

1000 500

250

0 0
0 sem 4 sem 8 sem 0.0 4.0 8.0 12.0
weeks of infection
Células de Langerhans Iad+ en epidermis separada
de ratones BALB/c infectados con L. (L.) mexicana

No estresado Estresado por 2 hr

Análisis morfométrico de lesiones de pacientes con LCL

Caracterización
Histopatológica
Ridley (Patrones I, II, II, IV)
Magalhaes (Patrones I, II, II, IV, V)

Análisis morfométrico:
Captura de Imágenes usando cámara Leica DFC420
acoplada a microscopio Leitz Diaplan

Grosor de la epidermis
Area de infiltrado inflamatorio
Densidad celular del infiltrado inflamatorio
Area de necrosis
 Grosor de la epidermis

Grosor de la epidermis
Trazando una línea longitudinal en el diámetro mayor y
líneas perpendiculares hasta cada una de las crestas
epidérmicas
 250
A Ridley 250
B Magalhaes
200 200
thickness
Grosor epidérmico

Grosor
MII
150 RIII 150 MIII
(mm)
(mm)

RIV
Epidermal

epidérmico
MIV
100 RV 100
MV

50 50

0 0
45 45
(mm2)area

40 40 **
infiltrate

35 35

Área infiltrado
Area infiltrado

30 RIII 30 *
granulomatoso

MII
(mm2)
Granulomatous

25 RIV 25 MIII

20

15
RV 20

15
MIV
MV granulomatoso
10 10

5 * 5

0 0

* (p < 0,05) en comparación con Ridley IV y V * (p < 0,03) en comparación con Magalhaes IV y V
** (p < 0,03) en comparación con Magalhaes III y IV
700 800

Densidad
600 700

600
MII
/ mm2 2)

500

celular del área

Cells/(mm

500 MIII
400 RIII
MIV
RIV 400

infiltrado
Células

300 MV
RV
300
200

granulomatoso
200

100
100

0 0

Histological
Patrones patterns
histológicos Histological
Patrones patterns
histológicos
 Presencia de necrosis en lesiones de pacientes LCL
según los patrones histologicos

A Ridley B Magalhaes
100
70 * **
90
60 80
*

necrosis
deofNecrosis
Presence of necrosis

70
50
de Necrosis

60
40
50
SI SI

Presence
Presencia
30 40
NO NO
Presencia

30
20
20
10
10

0 0
RIII RIV RV MIII MIV MV

* (p < 0,001) en comparación con Ridley IV * (p < 0,001) en comparación con Magalhaes V
** (p < 0,001) en comparación con Ridley IV
Gracias
@ftapia

felix.tapia@gmail.com

https://fjtapia.wordpress.com/

http://saber.ucv.ve/