Espectroscopía

1
MÉTODOS ANALITICOS
 CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO ANALÍTICO

 EXACTITUD : Grado de concordancia entre el valor obtenido de la
concentración del analito en la muestra y el valor verdadero.
 PRECISIÓN: grado de concordancia mutua entre un grupo de resultados
obtenidos al aplicar repetitiva e independientemente el mismo método
analítico a alícuotas de la misma muestra.
 SENSIBILIDAD: capacidad de un método analítico para discriminar
entre concentraciones semejantes del analito en la muestra o capacidad para
poder detectar (análisis cualitativo) o determinar( análisis cuantitativo)
pequeñas concentraciones del analito en la muestra.
 SELECTIVIDAD: Capacidad de un método para originar resultados que
dependan de forma exclusiva del analito para su identificación o
cuantificación en la muestra.
 ROBUSTEZ: Propiedad de un método analítico, que describe su
resistencia al cambio de respuesta (resultado) cuando se aplica
independientemente a alícuotas de la misma muestra variando ligeramente
las condiciones experimentales. (Selecciona y cuantifica los “puntos
débiles” experimentales).
2
 CLASIFICACIONES DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS
Referencia
CALIBRACIÓN
CALIDAD
Absolutos Estándar
Estándar de referencia
Estequiométricos
Validado
Comparativos
Ataque y/o disgregación
ETAPA DEL PROCESO
Transformación
Separación y/o preconcentración
Químicos
Medida de la señal
Físico-Químicos
Tratamiento de datos
3
METODOS QUÍMICOS O CLASICOS
Se basan en reacciones químicas estequiométricas aA+bB Ab Ba
 Métodos Volumétricos
 La propiedad medida es un volumen
 El analito se determina por el volumen gastado de un reactivo de
composición perfectamente conocida (sustancia patrón)
La condición de estequiometria (equivalencia) se detecta con un indicador
adecuado
4
METODOS QUÍMICOS O CLASICOS
 Métodos Gravimétricos
 La propiedad medida es la masa.
 El analito se aísla en forma pura o formando un compuesto de
estequiometria definida.
Son los métodos más exactos
5
METODOS FISICO-QUÍMICOS O INSTRUMENTALES
relacionada con la masa o la concentración de la

 Se basan en la medida de una propiedad analítica
 ESPECTROSCOPICOS
 Espectrometría óptica
 Espectrometría de masas
 Espectrometría electrónica
 ELECTROANALITICOS
 Electródicos
 Iónicos
especie a analizar. Se clasifican :
 OTROS MÉTODOS
 TERMICOS
 Termogravimétricos
 De barrido diferencial
 Térmico diferencial
 Valoraciones termométricas
 CINETICOS
Catalíticos
No catalíticos
 DE SEPARACIÓN
 Cromatográficos
 No cromatográficos
6
METODOS ESPECTROSCÓPICOS
 Dan lugar a la obtención de un espectro característico de los constituyentes de la muestra

que se produce como resultado de la excitación de los átomos o moléculas con energía
térmica, radiación electromagnética o choques con partículas (electrones, iones o
neutrones)
FUENTES DE Energía Energía Choques con

EXCITACIÓN Térmica Electromagnética partículas
Campos
magnéticos
MUESTRA A ANALIZAR
MEDIDA DE FOTONES ELECTRONES IONES
Espectrometría Espectrometría Espectrometría

7
óptica de electrones de masas
METODOS ÓPTICOS
Métodos que miden la radiación electromagnética que emana de la materia o que
interacciona con ella
 ESPECTROSCÓPICOS
 Se basan en la medida de la intensidad de los fotones (electrones e iones) en función
de la longitud de onda de la energía radiante (espectros) debida a transiciones entre los
estados de energía característica de los componentes de la muestra
 Pueden ser de tres tipos :
 De Absorción : La muestra se somete a una radiación y se determina la fracción
de radiación absorbida
 De Emisión: La muestra se expone a una fuente que hace aumentar su
contenido energético en el estado de alta energía (excitado) y parte de la energía
en exceso se pierde en forma de radiación
 De Dispersión (Scattering) : Se mide la fracción transmitida en todas las
direcciones a partir de la trayectoria inicial
8
 NO ESPECTROSCÓPICOS
 Se basan en interacción entre la
radiación electromagnética y la
materia cuando la radiación es
considerada únicamente como una
onda
Refractometría
Refracción Interferometría
ondulatorias
Propiedades
Polarimetría
Dispersión Nefelometría
Turbidimetría
Difracción De Rayos X
9
MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS
BASADOS EN LA MEDIDA DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
10
CONTENIDOS
1. Introducción
Métodos Instrumentales de Análisis:
– Métodos ópticos. Clasificación
– Radiación electromagnética
– Espectro electromagnético
2. Absorción de radiación electromagnética
3. Fundamentos de la espectrofotometría de absorción UV-Vis

– Teoría de la absorción de radiación UV-Vis
– Espectro de absorción
– Especies absorbentes. Tipos de transiciones electrónicas
– Bases del color
4. Leyes de la absorción de la radiación: Ley de Lambert – Beer

– Limitaciones y Desviaciones de la Ley de Beer
5. Instrumentación
6. Aplicaciones analíticas
– Características analíticas del método
– Análisis cuantitativo. Detalles del procedimiento experimental
– Aplicaciones al análisis de alimentos
11
1. Introducción
Métodos Instrumentales de Análisis

Están basados en la medida de propiedades químicas y físicas de los analitos
con fines cualitativos y cuantitativos.
La medida se realiza en un instrumento apropiado.
Propiedad medida Método Instrumental Método

Instrumental
Absorción de radiación Espectrofotometría de Óptico
absorción
Emisión de radiación Espectroscopía de emisión Óptico
Potencial eléctrico Potenciometría Electroanalítico
Corriente eléctrica Voltamperometría Electroanalítico
Resistencia eléctrica Conductimetría Electroanalítico
12
1. Introducción
Métodos ópticos de análisis
Métodos que miden alguna propiedad de la radiación electromagnética
emitida por la materia o que interacciona con ella
Clasificación
Métodos espectroscópicos: Existe intercambio de energía entre la
radiación electromagnética y la materia
•Métodos de absorción: Miden la disminución de la potencia de la
radiación electromagnética debida a la absorción que se produce en su
interacción con el analito
•Métodos de emisión: Miden la radiación electromagnética emitida
cuando el analito es excitado por energía térmica, eléctrica o radiante
Métodos no espectroscópicos: Se producen cambios en la dirección o en
las propiedades físicas de la radiación electromagnética:
Dispersión
Refracción
Difracción
Rotación óptica
13
1. Introducción
La radiación electromagnética
• La radiación electromagnética es una forma de energía que

se transmite por el espacio a gran velocidad sin soporte de
materia.
• La radiación electromagnética puede describirse según:
la teoría ondulatoria: formada por ondas sinusoidales
la teoría corpuscular: flujo de partículas o corpúsculos de

energía llamados fotones
14
1. Introducción
Teoría ondulatoria . Parámetros ondulatorios
• La radiación electromagnética (REM) se representa como ondas
consistentes en campos eléctricos y magnéticos que están en fase y que
oscilan sinusoidalmente de manera perpendicular entre sí y respecto a la
dirección de propagación
Parámetros ondulatorios
Campo eléctrico y Longitud de onda λ
Amplitud A
•La potencia P: es la energía del haz que llega

Campo magnético z Dirección x a un área dada por segundo
15
1. Introducción
Teoría corpuscular. Propiedades corpusculares de la radiación electromagnética

La radiación electromagnética es considerada como paquetes discretos de
energía llamados fotones o cuantos.
Dualidad onda-partícula:
Un fotón es una partícula de radiación electromagnética con masa cero y energía
E proporcional a la frecuencia de la radiación ϑ
La energía de un fotón: E = h ϑ
•E = energía del cuanto de radiación: Cal mol-1
•ϑ = frecuencia de la radiación : hertzio (Hz) = ciclos s-1
•h = constante de Planck = 6,624 • 10-27 erg s λ
Velocidad de la luz : v = ϑ λ µm = 10-6 m
Velocidad de la luz en el vacío: c = 3,00 • 1010 cm s-1 nm = 10-9 m
Å = 10-10 m
Energía de un fotón :E = h ϑ = h c /λ
Cuando λ aumenta, disminuye la energía y frecuencia del fotón
16
1. Introducción
Espectro electromagnético
• Abarca un intervalo muy amplio de

longitudes de onda o energías.
• Según su λ recibe diferentes

nombres.
• La luz visible, que es la única

perceptible por el ojo humano,
representa solamente una
pequeña parte del espectro, desde
350-380 a 750-780 nm.
17
Absorción: proceso por el cual una especie, en un medio

transparente, capta selectivamente ciertas frecuencias de la
radiación electromagnética.
El fotón absorbido hace pasar a la especie de su estado
fundamental a un estado excitado de energía M*:
M + h ϑ → M*
Tras un corto período de tiempo, aproximadamente 10-8 a 10-9 s,
se pierde la energía de excitación, generalmente en forma de
calor, y la especie M vuelve a su estado fundamental:
M* → M + calor
Los métodos de absorción tienen la ventaja de producir poca o
ninguna alteración en el sistema estudiado.
18
Requisitos
Para que la radiación electromagnética sea absorbida por la materia

deben cumplirse dos condiciones generales:
1) debe haber una interacción entre el campo eléctrico de la
radiación y alguna carga eléctrica de la sustancia
2) La energía de la radiación incidente debe ser exactamente igual
a la energía cuantizada que requiere la sustancia.
Ecuación de Bohr
ΔE = Ef – Ei = h ϑ
h ϑ: energía del fotón absorbido
Ei: energía total de la materia en el estado fundamental
Ef: energía total de un estado permitido de energía superior o estado
excitado.
19
3. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible
Método instrumental óptico basado en la medida directa de la

absorción de radiación electromagnética UV-Visible, por las
moléculas del analito contenido en la muestra.
• La región ultravioleta comprende entre 10 y 400 nm y la

región visible comprende entre 350 y 750 nm.
• Las radiaciones UV y visible tienen en común el hecho de

que la absorción de ambas regiones por moléculas, provoca
la excitación de e- de enlace a niveles de E superiores.
• Los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos

de enlaces de la especie absorbente, base de su aplicación
cualitativa
20
•Un analito molecular tiene la capacidad de absorber ciertas

longitudes de onda características de la radiación
electromagnética UV-Visible.
•En este proceso, la radiación es transferida temporalmente a la
molécula y, como consecuencia, disminuye la intensidad de la
radiación.
•Dicha disminución, debida a la absorción experimentada por el
analito, puede ser cuantificada utilizando diversas magnitudes,
siendo la Absorbancia, A, la más comúnmente utilizada en la
espectrofotometría de UV-Vis.
La aplicación cuantitativa de la espectroscopía de absorción
UV-Vis se basa en la medida, a una λ fija, de la A de una
disolución del analito contenida en una cubeta transparente de
camino óptico b cm.
21
Transiciones energéticas en la molécula del analito
E2
ΔE2 = E2-E1=hδ2= hc/λ2
E1
ΔE1 = E1-E0=hδ1 = hc/λ1

E0
22
Atenuación de un haz de radiación por

una especie absorbente contenida en la
cubeta
Espectro de absorción
Disolución de analito de
concentración c
Radiación
incidente Radiación
Absorbancia A
P0 transmitida
P
Cubeta
b
λ, nm
Transmitancia = T = P/P0
Absorbancia = A = - log %T = log P0 /P
23
Transmitancia y absorbancia
Transmitancia: fracción de radiación que una sustancia deja pasar cuando la

REM atraviesa la muestra.
Transmitancia = T = P/P0
T puede valer desde 0 hasta 1. %T puede valer desde 0 hasta 100 %
Absorbancia: es la atenuación de la intensidad de la radiación cuando ésta

incide sobre una muestra. Es la cantidad de energía que la sustancia toma para
pasar a un estado más excitado.
A aumenta a medida que aumenta la atenuación de la radiación.
Cuando no hay absorción de radiación Po= P y entonces A = 0,, mientras que si
se absorbe el 100 % de la radiación, no se transmite, la A = 2
24
Espectros de absorción
 Un espectro de absorción es una
representación gráfica de la
absorbancia de un analito (o de otra
magnitud equivalente) en función de la
Absorbancia A
longitud de onda de la radiación λ (o de
otro parámetro relacionado con la
energía de la radiación utilizada).
El máximo de absorbancia obtenido λmax λ nm

en el espectro de absorción de un
analito, nos dará la longitud de onda
que proporciona la mayor sensibilidad
posible, y por tanto será la que se
utilizará en el análisis
espectrofotométrico de dicho analito.
25
Teoría del color

•La sensación de color se produce cuando disminuye
apreciablemente una o más zonas de la región visible.
•Si el ojo recibe luz de todas las λ de la región visible el efecto es
luz blanca.
•El color aparente siempre es el color complementario del que ha
sido eliminado.
•Los colores complementarios son útiles para predecir la λ de
absorción de los compuestos coloreados: una disolución
amarilla, absorberá luz azul 450-480 nm, para analizarla debemos
usar luz con esta λ seleccionada con el monocromador o bien
usar un filtro azul, que transmite esta luz azul
26
complementario
λ (nm) Color absorbido λ (nm) Color observado
380-420 violeta 520 - 550 amarillo-verde
420 - 440 azul-violeta 550 - 580 amarillo
440 - 470 azul 580 - 620 anaranjado
470 - 500 verde-azul 620 - 680 rojo
500 - 520 verde 680 - 780 púrpura
520 - 550 amarillo-verde 380 - 420 violeta
550 - 580 amarillo 420 - 440 azul-violeta
580 - 620 anaranjado 440 - 470 azul
620 - 680 rojo 470 - 500 verde-azul
680 - 780 púrpura 500 - 520 verde
Una disolución se observa de color azul cuando se ilumina con luz policromática, porque absorbe λ
580-620 nm (anaranjado) y transmite o deja pasar λ 440-470 nm (azul)
27
Teoría de la absorción molecular. Cambios de energía durante la absorción

Absorción molecular
• Para cada estado electrónico en
una molécula existen varios VIS UV 3
estados vibracionales y para cada 2
1
uno de éstos, numerosos niveles E E2 0
rotacionales.
• Etotal= Eelectrónica + Evibracional + Erotacional

3
2
• La radiación absorbida por la E1

1
0
molécula puede ser utilizada
para originar las diversas
transiciones electrónicas
posibles.
3
• ΔE = Ef – Ei = h ϑ = Energía del E0
2
1
fotón absorbido λ1 λ4 λ´1 λ´4 0
Diagrama de niveles de energía

28
Especies absorbentes
* Las especies absorbentes: moléculas orgánicas y

aniones inorgánicos que tienen electrones:
• en orbitales moleculares σ
* • en orbitales moleculares π
• en orbitales no enlazantes n.
Tipos de transiciones electrónicas : Cuando

n absorben fotones de E adecuada se pueden dar 4
tipos de transiciones electrónicas:
 •σ→σ*
• n→ σ *
 • π → π*
• n→ π*
Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares

29
Sus electrones más exteriores o electrones de enlace

Especie pueden ser elevados a niveles de E más altos al incidir
absorbente sobre ellas una radiación electromagnética apropiada
• Grupo atómico presente en una molécula que lleva
asociada una banda de absorción electromagnética:
C=C; C=O; C=N.
Grupo
• Especies con grupos funcionales con enlaces π.
cromóforo
• Grupos cromóforos →dobles y triples enlaces.
• Bandas en el UV cercano y visible.
• Etileno, carbonilo, éster, amida, nitro…
Grupos que no producen por sí mismos bandas de

Grupo absorción, pero intensifican la de los grupos
auxocromo cromóforos: C-Br; C-OH
Bandas de Responsables del color de muchos iones y compuestos de

campo ligando metales de transición que poseen orbitales d y f
30
4. Leyes de la absorción de la radiación
Ley de Lambert-Beer
Al interaccionar la radiación electromagnética con la materia, tiene lugar la
absorción si la ϑ de la radiación coincide con la energía necesaria para que el
sistema pase a un nivel de energía superior y permitido
h ϑ = E2 - E1
Las dos leyes fundamentales que rigen el comportamiento de la fracción de
la radiación incidente absorbida al pasar a través de una muestra dada son:
Ley de Lambert: predice el efecto que produce el espesor del medio-muestra

sobre la fracción de radiación que se absorbe.
Ley de Beer: establece el efecto de la concentración del medio-muestra

sobre la fracción de radiación que se absorbe.
31
Ley de Lambert-Beer: muestra cómo la absorbancia es directamente

proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de la solución y a la
concentración c del analito o especie absorbente.
A  a·b·c A   ·b·c
a: cte de proporcionalidad llamada absortividad. (unidades L/cm·g, si c=g/L)
b: longitud del camino que recorre la radiación a través del medio absorbente.
c: concentración expresada en g/L (mg/L, ...).
Si la concentración c viene expresada en mol/L, la cte de proporcionalidad se denomina
absortividad molar y se representa por  (unidades L/cm·mol).
La absortividad molar, , es característica de cada especie a una λ determinada
32
Potencia del haz

Ley de Lambert- Beer antes de
atravesar la
muestra
Absortividad
Absorbancia molar Concentración molar
P0 de las especies
=bc
total medida
a la longitud
AT,l = log absorbentes
P
de onda l
camino
óptico
Potencia del haz

P después de
P0
= Transmitancia (T) atravesar la A=bc
muestra
A = -logT
Ley de Lambert- Beer 33
Comprobación de la Ley de Beer. Curva de calibrado
• La Ley de Beer debe comprobarse siempre antes de utilizarla para un análisis

cuantitativo exacto.
• Para ello se preparan una serie de disoluciones estándar del analito en el
intervalo en el que se supone que se encuentra la muestra.
• Se registra el espectro de absorción utilizando una de ellas.
• Se mide la absorbancia de dada una de las disoluciones a la λ del máximo de
absorción del analito con una longitud de cubeta dada, generalmente 1 cm.
• Se representan las absorbancias en función de las concentraciones.
• Si la ley de Beer se cumple en todo el intervalo de c estudiado: A = εbc se
obtiene una línea recta en todo el intervalo, que pasa por el origen.
• La recta obtenida se llama Curva de calibrado.
• Pueden aparecer desviaciones positivas o negativas a partir de una
determinada concentración debido a Limitaciones de la ley de Beer y/ó a
posibles errores experimentales cometidos
34
Desviaciones de la Ley de Beer

La proporcionalidad directa entre absorbancia y concentración cuando b es constante, sólo
se cumple en un intervalo de concentraciones del analito.
Fuera de dicho intervalo se observan en las curvas de calibrado desviaciones positivas o
negativas de la linealidad debido a las limitaciones de la Ley de Beer:
A
respuesta debida
a la autoabsorción
A= εbc o a la luz escasa que
Intervalo
atraviesa la cubeta
respuesta del blanco, lineal
interferencias o escasa
sensibilidad
concentración
Para la aplicación cuantitativa, las medidas de A de la muestra deben estar incluidas

en el intervalo lineal
35
Limitaciones de la Ley de Beer
• Limitaciones propias o reales

– Variación de la absortividad con el índice de refracción n, que varía con la c.
– Para c < 0,01 M n= cte: Ley de Beer se cumple.
• Incumplimiento de las premisas de la ley de Beer.

– Interacciones entre el soluto y la radiación producidas por mecanismos
distintos al de absorción.
– Interacciones entre las especies absorbentes del soluto .
– Radiación no monocromática.
36
Errores al aplicar la Ley de Beer

• Errores químicos.
– Efectos debidos a sistemas en equilibrio:
• equilibrios de dimerización
• equilibrios ácido-base
• equilibrios de complejación
– Efectos debidos al disolvente.
– Efectos debidos a impurezas absorbentes de los reactivos.
– Efectos debidos a la presencia de interferencias absorbentes en la
muestra.
• Errores instrumentales.
– Errores de lectura:
• El mínimo error relativo se obtiene para una absorbancia de 0,434
• Las absorbancias deben estar comprendidas entre 0,2 y 0,8 para obtener
el mínimo error
– Radiación parásita.
• Errores personales:
– Utilización y cuidado de las cubetas de absorción.
37
– Control de Temperatura.
5. Instrumentación
Componentes básicos de los espectrofotómetros
Fuente de Dispositivo de
Selector Cubeta Detector
energía lectura
de λ muestra
radiante
Muestra
Monocromador Detector
Fuente de
radiación
Luz Luz
compuesta monocromática I
I0 b
38
5. Instrumentación
Fuente de energía radiante
Características
Continua. Estable. Intensa
Lámpara de
intensidad lumínica
Lámpara de Para λ en
Tungsteno o Wolframio
Deuterio el Visible
300 500 700 900 1100

Para λ en el
longitud de onda (nm)
Ultravioleta
39
5. Instrumentación
Selector de λ
Características
•longitud de onda de máxima transmisión

•ancho de banda efectivo
Monocromadores de prisma
Filtros de corte
Monocromadores de red
Filtros de absorción
Filtros de interferencia
Fotómetros Espectrofotómetros
40
5. Instrumentación
Cubetas
Características
Absorción mínima a la longitud de onda de trabajo

Colocar con caras transparentes perpendiculares a la dirección del haz incidente
Sílice Vidrio o plástico
Ultravioleta Visible
41
5. Instrumentación
Detectores
Su función es convertir la respuesta del instrumento en una señal medible.
Características
•deben responder a un amplio rango de longitudes de onda

•deben dar respuesta rápida
•deben ser sensibles a bajos niveles de radiación
•deben producir señal eléctrica fácilmente amplificable
•la señal debe ser proporcional a la potencia radiante
Fototubos Fotomultiplicadores Fotodiodoarray
42
5. Instrumentación
Espectrofotómetros
Haz sencillo
Fuente de Sistema Cubeta de Registrador

radiación selector de Fotodetector Amplificador o PC
λ muestra
Cubeta de
referencia
Doble haz
Cubeta de Fotocelda 1
muestra
Fuente de Sistema Amplificador Registrador
selector de diferencial o PC
radiación λ
Cubeta de
Fotocelda 2
referencia
43
La espectrofotometría de absorción molecular se puede aplicar tanto al análisis

cualititativo como cuantitativo.
Análisis cualitativo: los espectros de la muestra se comparan con los de los

correspondientes estándares, con el fin de identificar las bandas de absorción
coincidentes. Este tipo de análisis es más frecuente en UV e IR para identificar
compuestos orgánicos y más rara vez se utiliza en Vis.
Análisis cuantitativo: está basado en la ley de Lambert-Beer en el intervalo de

concentraciones de cumplimiento de la ley.
•Se establece la curva de calibrado usando estándares y la absorbancia de la
muestra de concentración desconocida se remite a la curva (a veces basta con un
solo estándar).
•En espectrofotometría Vis, el analito se suele incorporar a una especie compleja
que presente bandas de absorción intensas.
•Siempre que sea posible se debe medir la absorbancia a λmax
44
Características de los métodos espectrofotométricos

 Amplia aplicabilidad: Análisis orgánico e inorgánico
 Elevada sensibilidad: los límites detección de 10-4 a 10-5 M.
 Selectividad de moderada a alta.
 Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso menores.
 Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas.
 Se prestan a una fácil automatización.
Campo de aplicación
 Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan grupos
cromóforos y especies inorgánicas como son los metales de transición.
 Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivo para
producir un compuesto absorbente.
45
Metodología cuantitativa. Detalles del procedimiento experimental
Toma y tratamiento de la muestra

•Realizar un espectro de absorción de la muestra
Selección de la •Para obtener máxima sensibilidad, realizar las medidas de A
longitud de onda a una λ que corresponda a un máximo de absorción λmax, ya
que el cambio en la absorbancia por unidad de concentración
es mayor en este punto.
•la naturaleza del disolvente

Control de las variables •el pH de la disolución
que influyen en la absorbancia •la temperatura
•las concentraciones altas del electrolito
•la presencia de sustancias interferentes
Elegir las condiciones para el análisis
 Determinación de •Calibración con patrones de concentración conocida
la relación entre •Método de las adiciones estándar
la absorbancia A a) El método de un solo punto
y la concentración c b) El método de las adiciones múltiples
46
Calibración con patrones de concentración conocida
•Pocas veces es posible suponer el cumplimiento de la ley de Beer y utilizar un

único patrón para determinar la absortividad molar.
•Comprobar la ley de Beer realizando un calibrado a la λ del máximo de
absorción.
•Se miden las absorbancias de patrones y muestras y se obtiene la ecuación de la
recta de calibrado generalmente aplicando el método de mínimos cuadrados:
• A = mc + b
•Los estándares o patrones de calibración se deben aproximar tanto como sea
posible a la composición final de las muestras reales y deben abarcar un intervalo
razonable de concentraciones del analito.
•La concentración de la muestra se calcula a partir de la ecuación de la recta de calibrado
sustituyendo su valor de A y despejando la c correspondiente
47
Calibración con patrones de concentración conocida
A (l = 508 nm)
A
muestra
Analito en la
muestra
48

Método de las adiciones estándar
Cuando se analizan muestras complejas, como alimentos ó cenizas
vegetales, suele ser imposible o muy difícil preparar estándares que se
asemejen a las muestras.
En este caso, el método de las adiciones estándar es útil para contrarrestar
los efectos de matriz.
Método de las adiciones estándar. El método de un solo punto

•Se toman dos porciones de la muestra
•Una porción se mide como de costumbre
•A la segunda porción se le agrega una cantidad conocida de la disolución
estándar de analito
•Ambas respuestas se utilizan entonces para calcular la concentración
desconocida, suponiendo una relación lineal entre la respuesta y la
concentración del analito
49
Método de las adiciones estándar. El método de un solo punto

•Absorbancia de la primera disolución
A1 = K cx
cx concentración desconocida de analito en la 1ª disolución
K constante de proporcionalidad.
•Absorbancia de la segunda disolución

A2 = (K vx cx / v t) +( K v s c s / v t)
vx volumen de la disolución de concentración desconocida de analito,

vs volumen agregado de la disolución estándar de analito,
v t es el volumen total después de la adición y
cs es la concentración de la disolución estándar de analito
cx = A1 v s c s / A 2 v t - A1 vx
50
•Varias alícuotas idénticas Vx de la solución desconocida con concentración Cx se

transfieren a matraces volumétricos de volumen Vt.
• A cada uno de esos matraces se le añade un volumen variable Vs de una
disolución patrón del analito, con concentración conocida Cs.
•Después, se añaden los reactivos que originan el color y se diluye cada solución
hasta un volumen Vt.
•Si el sistema químico sigue la ley de Beer,
A i= (ε b Vs Cs / Vt ) + (ε b Vx Cx / Vt ) = K Vs Cs + K Vx Cx
K es una constante = ε b / Vt
•Una gráfica de AI en función de Vs debe originar una recta de la forma
A i = m Vs + b
Donde la pendiente m y la ordenada en el origen b vienen dadas por
m = K Cs y n = K Vx Cx
•El análisis de mínimos cuadrados de los datos se puede utilizar para
determinar m y b; después, es posible calcular Cx a partir del cociente de esas
dos cantidades y los valores conocidos de Vx y Cs
Cx = (Cs / Vx ) ( n/m)
51
Método de las adiciones estándar . El método de las adiciones múltiples
A0 A1 A2 A3
A = mc+b 0 = mc muestra + b Cmuestra = b/m
c1 c2 c3 Concentración añadida del estándar

Concentración
de la muestra
52

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 CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO ANALÍTICO

Se basan en reacciones químicas estequiométricas aA+bB Ab Ba

relacionada con la masa o la concentración de la

 Dan lugar a la obtención de un espectro característico de los constituyentes de la muestra

FUENTES DE Energía Energía Choques con

MEDIDA DE FOTONES ELECTRONES IONES

Espectrometría Espectrometría Espectrometría

2. Absorción de radiación electromagnética

3. Fundamentos de la espectrofotometría de absorción UV-Vis

4. Leyes de la absorción de la radiación: Ley de Lambert – Beer

Métodos Instrumentales de Análisis

Propiedad medida Método Instrumental Método

• La radiación electromagnética es una forma de energía que

• La radiación electromagnética puede describirse según:

la teoría ondulatoria: formada por ondas sinusoidales

la teoría corpuscular: flujo de partículas o corpúsculos de

•La potencia P: es la energía del haz que llega

Teoría corpuscular. Propiedades corpusculares de la radiación electromagnética

• Abarca un intervalo muy amplio de

• Según su λ recibe diferentes

• La luz visible, que es la única

Absorción: proceso por el cual una especie, en un medio

Para que la radiación electromagnética sea absorbida por la materia

Método instrumental óptico basado en la medida directa de la

• La región ultravioleta comprende entre 10 y 400 nm y la

• Las radiaciones UV y visible tienen en común el hecho de

• Los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos

•Un analito molecular tiene la capacidad de absorber ciertas

ΔE1 = E1-E0=hδ1 = hc/λ1

Atenuación de un haz de radiación por

Absorbancia = A = - log %T = log P0 /P

Transmitancia: fracción de radiación que una sustancia deja pasar cuando la

Absorbancia: es la atenuación de la intensidad de la radiación cuando ésta

El máximo de absorbancia obtenido λmax λ nm

Teoría del color

Teoría de la absorción molecular. Cambios de energía durante la absorción

• Etotal= Eelectrónica + Evibracional + Erotacional

• La radiación absorbida por la E1

Diagrama de niveles de energía

* Las especies absorbentes: moléculas orgánicas y

Tipos de transiciones electrónicas : Cuando

Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares

Sus electrones más exteriores o electrones de enlace

Grupos que no producen por sí mismos bandas de

Bandas de Responsables del color de muchos iones y compuestos de

Ley de Lambert: predice el efecto que produce el espesor del medio-muestra

Ley de Beer: establece el efecto de la concentración del medio-muestra

Ley de Lambert-Beer: muestra cómo la absorbancia es directamente

Potencia del haz

Potencia del haz

Comprobación de la Ley de Beer. Curva de calibrado

• La Ley de Beer debe comprobarse siempre antes de utilizarla para un análisis

Desviaciones de la Ley de Beer

Para la aplicación cuantitativa, las medidas de A de la muestra deben estar incluidas

Limitaciones de la Ley de Beer

• Limitaciones propias o reales

• Incumplimiento de las premisas de la ley de Beer.

Errores al aplicar la Ley de Beer

Componentes básicos de los espectrofotómetros

Continua. Estable. Intensa

300 500 700 900 1100

•longitud de onda de máxima transmisión

Absorción mínima a la longitud de onda de trabajo