UNIVERSIDAD DE LAS

FUERZAS ARMADAS
“ESPE”
BIOLOGÍA MOLECULAR II
RAQUEL ANDRANGO
JOSELYN ESPINOSA
JEAN PIERRE MEJIA
 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS PARA
REALIZAR GELES DE POLIACRILAMIDA

OBJETIVOS
● Preparar los reactivos para el gel de poliacrilamida
● Determinar las funciones de cada uno de sus componentes
● Analizar y comparar las ventajas del gel de poliacrilamida
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

Separar y Identificación de mezclas de proteínas y péptidos, permitiendo separaciones por densidad de carga o por
tamaño molecular
Los geles sirven de tamices moleculares que potencian la separación.

Moléculas pequeñas Moléculas grandes Moléculas de tamaños

intermedios

• Desplazan • Quedan casi • Desplazan a

fácilmente a inmóviles través del gel
través del gel con diversos
grados de
dificultad.

✓ Los geles de poliacrilamida

✓ son químicamente inertes
✓ se forman con facilidad mediante polimerización de la acrilamida.
✓ Además variando la concentración de acrilamida y metilenbisacrilamida se pueden conseguir tamaño de poro
controlados
✓ Estables en un rango amplio de pH, temperatura y fuerza iónica
Buffer de Electroforesis pH=8,3
.

❖ Agente desnaturalizante SDS.

❖ separación de proteínas en función de su
tamaño.
❖ Las proteínas se despliegan y se recubren
con moléculas de detergente SDS.

Es el buffer de corrida se usa para obtener

una mejor resolución en un rango amplio de
peso molecular de proteínas.

Uso: disoluciones tampón

Tris Base Taponamiento: amino.
Función: Mantiene el pH.

SDS (Dodecil sulfato Detergente aniónico que se une a las proteínas

de sodio) Función: desnaturaliza proteínas, mantiene las proteínas con
carga negativa

Glicina Conductor de electricidad, fuente de

iones de arrastre
 Discontinua utiliza dos geles: Gel stacking y running (resolución )
Reactivos del Gel
La porosidad del gel la determina las
proporciones poliacrilamida y bis-
acrilamida +% - poro

TEMED,
Acrilamida: acrónimo
de N,N,N',N'-
Bisacrilamida • Genera radicales
tetrametiletileno
Gel resolución
libres
(catalizador) diamina pH 8,8
• Mantiene el pH • Bisacrilamida:
en el gel. agente de • iniciador de la • iniciador en cuyo pH se invierte la ubicación
(propagador)
reticulación reacción de de corrida de la glicina y el Cl- y se
polimerización
Persulfato producirá la separación de las
Tris HCl proteínas en este gel
amónico

Gel stacking
pH 6,8
Función: asegura la migración de
todas las proteínas en el frente
de migración, provocándose la
acumulación ( bajo %)
 GEL DE POLIACRILAMIDA

El gel de poliacrilamida es el resultado de la

polimerización química de una mezcla de
acrilamida y bisacrilamida.

Soporta mayores voltajes que la agarosa

Es susceptible de teñirse por varios procedimientos,

y también puede desteñirse en caso necesario.
BUFFER DE CARGA
Tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra

•Disociación de proteínas para

Bromofenol
permitirles correr a través del gel.

Tris HCl • Facilita su depósito en el pocillo,y

evita su salida del gel
Glicerol
• Simplificar la carga y monitorear
SDS el proceso electroforético
 Detergente Tampón Tinte Ayuda a la
aniónico marcador precipitación
de las
Desnaturaliza Regulación muestras de
Progreso de la
las proteínas. del pH proteínas
electroforesis

SDS Tris HCl Azul Glicerol

pH 6.8 Bromofenol
SOLUCIÓN DE TINCIÓN
40 Etanol ● Etanol: 100 mL
%
Azul de Coomassie R ● Azul de
0.12
5% - 250 Coomasie:
0.3125 g
75 Agua destilada ● Agua destilada:
% 125 mL

10 Ácido acético ● Ácido acético:

% 25 mL

Azul de Coomassie:
R-250
G-250
SOLUCIÓN DE DESTINCIÓN

5 Etanol
● 25 mL de
% Etanol
7. ● 37.5mL de
5 Ácido acético Ácido
% acético
CONCLUSIONES

❖ El gel de electroforesis sirve como un medio de soporte para la muestra,

con la finalidad de evitar perturbaciones mecánicas durante la separación
❖ El tamaño de poro del gel se controla con la concentración de acrilamida y
metilenbisacrilamida
❖ De una correcta tinción, destinción y fijado depende que podamos observar
la bandas con una claridad adecuada.