Morfologia

cromozomulu
i metafazic

Cariotipul uman
Cromozomi = elemente esentiale ale nucleului celular, suportul
genelor.

Genes per chromosome

 OM - 46
 MAIMUTA - 42
 CIMPANZEU - 48
 BOVINE - 60
 CAINE - 78
 PISICA - 38
 CAL - 64
 SOARECE - 40
 DROSOPHILA – 8
 CRAPUL -104
1. Elementele morfologice si functionale comune tuturor
cromozomilor: cromatidele, centromerul si telomerele.
 Telomeres

p arm

q arm

Telomeres
 TIPURI DE CROMOZOMI
(dupa raportul lungimii bratelor)

 cromozomi metacentriciq=p
 cromozomi submetacentrici (p=1/3L)
 cromozomi acrocentrici (p=1/10L)
q= (lungimea) bratul(ui) lung al
cromozomului
p= (lungimea) bratul(ui) scurt al
cromozomului
 2. Elementele comune unor cromozomi : constrictiile secundare si
satelitii.

Satelit

CONSTRICTIE SECUNDARA
p

CENTROMER

q
Constrictiile secundare se mai numesc regiuni
TELOMER organizator nucleolare (RON) implicate in
sinteza ARN ribozomal, in biosinteza ribozomilor
si nucleolilor.
morphology of chromosomes.

Satellite

P arm

Centromere
(primary constriction)

q Secondary constriction

telomere

Chromatid
 3. Elementele specifice fiecarui cromozom sunt benzile cromozomice.

 Bandarea evidentiaza, la
nivelul cromozomilor, cu
ajutorul anumitor
compusi chimici, niste
modele caracteristice
care constau intr-o
succesiune de benzi a
caror configuratie
depinde de compozitia in
baze azotate a
diferitelor regiuni ale
cromozomului, precum si
de tehnica de bandare
folosita.

 La cromozomii omologi,
pe langa dimensiunile si
forma similare se
observa si un model de
benzi similar, ceea ce
inlesneste recunoasterea
perechilor in vederea
alcaturii cariotipului.
 CARIOTIPUL UMAN NORMAL

Criterii de identificare, numerotare si clasificare a cromozomilor.

 Talia cromozomilor (1,5-10 microni)

L.r.c = p+q/22A+X .1000

 Pozitia centromerului si lungimea bratelor.

i.c = p/p+q .100
r = q/p
d = q-p

 Prezenta constrictiilor secundare si a satelitilor.

22 de perechi + XY/XX
7 grupe (A…G) + X, Y/X, X
 GRUPELE DE CROMOZOMI LA OM

CROMOSOMI Metacentrici Submetacentrici Acrocentrici

mari A (1-3) A (2); B (4-5)

mijlocii C (6, X); E (16) C (7-12) D (13-15)

mici F (19-20) E (17-18) G (21-22,Y)

BANDAREA CROMOZOMILOR
 Bandarea Q (Quinacrină)

 Benzile Q se obţin prin colorare directă

a preparatului microscopic cu
quinacrină (fluorocrom), urmată de
examinarea în fluorescenţă a acestuia.

 Y - polimorfism (o talie variabilă în

raport de extensia segmentului
fluorescent)
 Bandarea G (Giemsa)

 Benzile G se obţin prin

digestie enzimatică
controlată, cu tripsină,
în vederea denaturării
proteinelor cromozomiale,
urmată de colorarea
Giemsa.
Cariotip-bandare GTG
 Protocol de lucru:
Soluţii utilizate:
 Soluţie de atac enzimatic: tripsină 0,02g cu 50 ml PBS 1X;
 Soluţie de colorare: Giemsa 2% în apă distilată;
 Apă distilată.
Protocolul utilizat :
 Preparatele se introduc direct de pe placa histologică
fierbinte în soluţie de atac enzimatic (aflat la temperatura
camerei) timp de 12-15 secunde;
 Timpii optimi se testează pe o primă lamă pentru fiecare caz
în parte;
 Urmează o trecere rapidă prin soluţia de clătire intermediară
rece (+4˚C);
 Colorare la temperatura camerei timp de 2-3 minute;
 Clătire cu apă distilată;
 Uscare la aer.
 Bandarea R (reversie)

 Benzile R pozitive se obţin

prin denaturare termică
controlată a preparatelor
într-o soluţie salină,
urmată de colorare cu
acridin oranj (agent
fluorescent).
 Bandarea T (telomer)

 Benzile T se obţin printr-

un tratament specific, mai
puternic decât cel aplicat
în bandarea R, urmat de
colorare cu acridin-orange,
în zonele cromozomiale
telomerice apare o
fluorescenţă verde de
intensitate variabilă.
 Bandarea C (centromer)

 Benzile C se obţin prin tehnica de

denaturare – renaturare cu
hidroxid de bariu urmată de
colorare Giemsa

 apar în zone bogate în ADN înalt

repetitiv şi metil-citozină de la
nivelul centromerilor cu excepţia
cromozomului Y, la care banda
intens colorată este localizată în
regiunea distală a braţului q
 Bandarea NOR (organizatori nucleolari)

 Benzile NOR se obţin pe

preparate cromozomice prin
colorare cu nitrat de
argint

 apar în regiunile
corespunzătoare
organizatorilor nucleolari
situate pe braţul scurt al
cromozomilor acrocentrici
(grupele D şi G), la
nivelul constricţiilor
secundare
Caracteristici Benzi Q sau G Benzi R Benzi C

Localizare Bratele cromozomiale Braţele cromozomiale Centromerie,Yq

Compozitia bazelor Bogate în AT Bogate în GC Bogate în AT, unele în GC

Tip de secvente ADN Repetate, unele unice Unice, unele repetate Înalt repetate, ADN satelit

Tip de cromatina Heterocromatină Eucromatină Heterocromatina

Replicare La mijlocul şi sfârşitul fazei SLa începutul fazei S Sfîrşitul fazei S

Transcriptie Redusă Intensă Absenîa

Densitate genica Redusă Mare Absenţa

 Citogenetica

 conventionala - numarul si structura cromozomilor

bandati

 moleculara - detectarea cromozomilor specifici

sau a locilor specifici pe un cromozom (probe de
ADN marcate cu fluorocrom care se leaga special
pe acele regiuni ale cromozomilor care se
studiaza).
 Tehnici citogenetice clasice

 In analiza cromosomilor umani, cel mai frecvent folosit

material biologic este sangele periferic deoarece, este
cel mai accesibil si limfocitele prezinta un inalt
potential de crestere dupa stimularea lor cu un agent
mitogen.

 Cariotiparea se mai realizează şi din celule ale pielii,

lichidului amniotic, maduvei osoase etc.

 Celulele recoltate sunt cultivate (ramin vii) câteva zile

şi apoi prelucrate special ( sacrificarea culturii
celulare) pentru a obţine celule în diviziune, în care se
pot analiza cromozomii.
 Protocol de lucru:

 Se recoltează 5-10 ml de sânge venos pe heparină (anticoagulant);

 Se trece sangele recoltat intr-un vas steril de cultura care contine 10 ml mediu de
cultura (MEM sau RPMI) suplimentat cu ser fetal bovin, fitohemaglutinina si
antibiotice;
 Se incubeaza timp de 72 de ore, la 37°C, în condiţii sterile si se agita usor de
cateva ori pe zi;
 Se administreaza, dupa 70 ore, 0,1ml colchicină (împiedică formarea fusului de
diviziune şi opreşte mitozele în metafază) timp de doua ore

 Se centrifugheaza la 500g/min, timp de 10 minute

 Se transfera celulele centrifugate, dupa indepartarea supernatantului, în 10 ml
soluţie hipotonă (KCl) timp de 10 minute;

 Se incubeaza la 37oC pentru 10 minute

 Se centrifugheaza la 500g/min, timp de 10 minute
 Se fixeaza, dupa indepartarea supernatantului,in 10 ml fixator metanol-acid acetic
glacial ( in raport 3:1), se lasa la frigider timp de 30 minute;
 Se centrifugheaza la 500g/min, timp de 10 minute;
 Se efectueaza preparatele cromozomiale pe lame degresate prin picurarea unei cantităţi
mici de suspensie celulară cu ajutorul unei pipete Pasteur. Frotiurile se usucă la
aer;
Cariotip normal: 46,XY, individ de sex masculin Cariotip normal: 46,XX, individ de sex feminin
 Tehnici de citogenetica moleculara

 Hibridizarea în situ cu fluorescenţă

(FISH) este o metodă de
citodiagnostic molecular în care, are
loc hibridizarea, pe bază de
complementaritate, între o secvenţă
specifică din ADN-ul cromozomului
analizat (ADN ţintă) şi o sondă de
ADN.

Testele FISH se pot efectua pe

- nuclei interfazici din celule ale
lichidului amniotic
- celule ale vilozităţilor coriale
- limfocite, celule din măduva osoasă,
tumori solide
Tehnica FISH poate utiliza sonde
specifice pentru - regiunea
centromerică
- regiunea telomerică
- un locus dat
- cromozom, ce permit colorarea
specifică a acestuia (chromosome
painting).
 Un avantaj major al
FISH-lui este faptul că se
poate realiza pe celule
interfazice. În acest sens sunt
folosite sonde specifice, în
diagnosticul prenatal - pentru
cromozomii 13, 18, 21, X si Y
Preparatele obţinute
sunt examinate la microscopul
cu fluorescenţă, urmărindu-se
semnalele fluorescente din
fiecare nucleu, în vederea
detectării modificărilor
survenite la nivelul
materialului genetic.

Tipuri de sindroame identificate prin tehnica FISH interfazic

verde = cromozomul 13
rosu= cromozomul 21
bleu = cromozomul 18
verde = X
rosu = Y
 Aspect normal al nucleului
Aspect normal al nucleului interfazic(sex interfazic(sex masculin)
feminin)
FISH în sindromul Down FISH la sindromul Edwards