1

QuickTime™ and a
TIFF (Uncompressed) decompressor
are needed to see this picture.

2
“Nothing in biology makes sense 
except in the light of evolution”

P.A.Naidu,
                               sarubujjili.

3
 Biochemistry 441
  Lecture 14
Ted Young
February 5, 2007
The utility of complementarity

Denaturation and renaturation of nucleic acids
 First midterm exam on Wednesday
Room assignment:
Students with last names beginning A­K
Kane 110
Students with last names beginning L­Z
Kane 210
Exam will cover material on lectures 1­10.
 Open Study Time with the TAs:Tuesday, February 6th:Room: 
HSB BB1602; Time: 10:00am to 1:50pm

5
 Summary of Lecture 13
DNA structure is deceptively simple and 
repetitive
B form DNA is the predominant form that 
exists in nature
RNA structure is exceedingly complex; the 
structure of relatively few RNA molecules 
is known. Accurate predictions of the 
secondary structure of RNA is 
difficult/impossible.
The complex structure of RNA allows it to 
have multiple roles in biology­including 
enzymatic functions­which were probably 
important during evolution.   6
 Denaturation of nucleic acids: ds DNA
The forces that hold 
the two strands of 
DNA together are all 
weak forces and 
therefore the two 
strands can be easily 
separated.
Common denaturing agents in the lab:
Heat, high pH, and strong H­bonding agents 
such as urea and formamide. ((Why not water?)) 
Why not low pH?
To function in vivo as a template for DNA and RNA synthesis the
two strands must be separated using enzymes 7
Denaturation of nucleic acids: ds DNA
The denaturation  or 
“melting” of double­
stranded DNA occurs 
over a very narrow 
temperature range, 
indicating that it is a 
highly cooperative 
process.
The temperature at the 
midpoint of the 
melting curve is 
known as its melting 
temperature or Tm. 
8
 Energetics of denaturation
∆G = ∆H ­ T∆S
helix coil

One molecule two molecules,
Few conformations many conformations
For the helix to be stable ∆G must be >0. 

∆S = Scoil ­ S helix > 0 therefore T∆S is negative.
Therefore, for the helix to be stable ∆H must be larger in 
a positive sense than T∆S is negative.    ∆H  >  T∆S
∆H is positive because there are strong interactions
between bases­both H­bonds and base stacking due to
 van der Waals interactions between the bases.
These must be stronger than the repulsive forces of the
negatively charged phosphates which are partially neutralized by interaction
with Na+, K+ and positively charged Lys and Arg of the histone proteins.  9
Energetics of denaturation­continued

As the Temperature increases, ∆G approaches 0.
At the Tm, ∆G = 0 and Tm = ∆H/∆S.
∆H depends on base sequence and composition whereas
∆S does not; therefore helices with higher G+C content
(3  bp versus 2 for AT pairs; and more stacking of
 GC pairs) will have a higher melting temperature

10
 Base­pairing in nucleic acids

Standard Watson­
Crick base pairs
Note that for both G/C and A/T
bp the hydrogen bond donors
and acceptors shown are the 
only ones possible if the 
positions of the C1’ atoms 
maintain the geometry of the B 
helix. Other pairing can occur 
in unusual DNA structures­for 
example at the ends of 
chromosomes Hoogsteen base­
paired “G­quartets” are found.  11
Base­pairing in nucleic acids­evidence 
for pairing in solution
Infrared
spectra
of bases­
N­H region
of the 
spectrum.

Only for G+C does the IR spectrum change, implying that
the N­H bonds are altered; this change is seen only for 
standard
Watson­Crick base­pairs: G­C and A­T; not G+T, A+C, T+C, 12
Base­stacking plays an important role in 
stabilizing double­stranded DNA
Studies of the osmotic pressure, π, of solutions of “free”
bases demonstrates that they aggregate.
π = RTm where R=gas constant, T=temp, m=molal
concentration­a measure of the number of 
molecules in solution.
For substances that 
aggregate:

π= φRTm, where φ=osmotic coefficient (which has a value 
between 0 and 1); in other words, the effective number of 
molecules in solution is reduced by aggregration, and this 
reduces the osmolarity. 13
Evidence for base stacking in solution

The reduction in φ is not
due to H­bonding between
bases since N6,N6 methyl
adenine can’t H­bond and
shows the greatest 
reduction in φ.

14
 Tm can be used to characterize DNA 
from different organisms
Melting temperature is
affected by (G+C) 
content, ionic strength,  0.015 M NaCl
0.0015M Na Citrate
and solutes that affect 
hydrophobic and H­
bonding interactions. In 
general, agents that 
disrupt H­binds or base 
stacking 
_(increase/decrease)______

the Tm. Low ionic 
strength (dashed curve) _ 
_(increases/decreases)______ 
_______ it. 15
 Tm continued

Tm does not depend on size of the DNA 
afer a certain size is reached.
For short oligonucleotides :
Tm~1.5o(A+T) + 3.5o (G+C) in  
o
centrigrade. A,T,G,C=number of bp.
For a large DNA of ~50%(G+C) Tm ~ 85o 
so obviously the relation fails after a certain 
size. Determine an approximate upper limit 
for this equation.
16
 Structure of denatured DNA
Rapidly cooling of denatured 
DNA leads to imperfectly 
base­ paired single strands of 
DNA. The figure illustrates 
intra­strand base­pairing that 
has normal W/C 
complementarity and 
orientation.
Questions to consider:
About how much base pairing would occur 
when a DNA solution is rapidly cooled?
Would all denatured DNA molecules form the 
same structure?
Would both strands of a double helix form the 
same structure?
Would single strands of DNA and RNA of the 
same sequence form the same structure? 17
 Intercalating dyes can distinguish 
double­stranded from single­stranded 
DNA in cells

Red luminescence

QuickTime™ and a
TIFF (Uncompressed) decompressor
are needed to see this picture.

Green fluorescence
18
Acridine orange binds to DNA and RNA
in the cell

Nucleus and
nucleoli

This method can 
QuickTime™ and a
TIFF (Uncompressed) decompressor
detect denaturation
are needed to see this picture. In vivo.

19
 DNA­DNA and DNA­RNA 
hybridization
Single­stranded nucleic acid molecules 
that are completely or even partially 
complementary will react with one 
another via hydrogen­bonding to form 
stable double­stranded molecules. 

radioactive

heat
+ +

(DNA or RNA) Stability: 20
 EM of partially denatured DNA

“Annealing” or hybridization of 
two related but not completely 
complementary single­stranded
DNA or RNA molecules would 
Produce a similar picture; the 
locationand size of the single­
Stranded regions would identify the
location and extent of sequence
divergence.

21
 Annealing of nucleic acids is important 
in most experimental manipulations in 
the laboratory
­DNA sequencing/DNA synthesis to make probes
­Polymerase chain reaction (PCR)
­oligonucleotide mutagenesis
­creating recombinant DNA molecules
­detecting/measuring DNA/RNA isolated from cells
­determining relatedness between species (formerly)
22
 Separation and reannealing of DNA 
strands is  important in vivo

Every process we talk about (with one 
exception) involves separation of DNA 
strands and rewinding of the helix.
Since strand separation involves putting 
energy into the system, enzymes and 
proteins are involved in unwinding of the 
DNA. 

23