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cromatográficas
CROMATOGRAFIA = método de
separação no qual os constituintes de
uma amostra a serem separados são
distribuídos entre 2 fases:
éter de
petróleo
mistura de
pigmentos
CaCO3 pigmentos
separados
Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
Décadas de 30 – 40 MARTIN & SYNGE:
cromatografia partição
Década de 50:
TLC e GC
Década de 60:
cromatografia permeação em gel
Décadas de 70 e 80:
HPLC moderna
Cromatograma
É o resultado da cromatografia.
Cromatógrafo
É o equipamento através do qual se faz a
cromatografia.
Tempo de retenção
É o tempo que um analito fica em contato com a fase
estacionária
Fase Estacionária: Sílica (polar)
Fase Móvel: Hexano (apolar)
Frente do solvente
Nível do solvente
Amostra
120
100
Massa residual (mg)
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
Separação dos componentes da amostra
CROMATOGRAFIA
CFS CL CG
Cromatografia a Cromatografia a Cromatografia a
Fluido Supercrítico Líquido Gás
CL CL
Planar Coluna
íons
H H F F O O
H H F F O O
POLAR:
δ + δ - δ - δ + δ - δ +
H Cl O H N H
Descrição dos grupos de EXEMPLOS
substâncias
Apolares Hidrocarbonetos, lipídeos,
polímeros plásticos...
FASE MÓVEL
FASE ESTACIONÁRIA
(sólida)
QUÍMICA = formação de ligações químicas
FÍSICA = envolve interações como pontes de
hidrogênio, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido,
etc
Exemplos:
• Sílica gel
• Alumina
• Florisil
• Carvão
• Carbonato de cálcio
polar
Fluxo
apolar
Separação de misturas em classes de
compostos de diferentes polaridades
FASE MÓVEL
Sempre de polaridade contrária
Alta estabilidade
FASE ESTACIONÁRIA
Líquido é quimicamente ligado ao suporte
sólido.
FASE MÓVEL
Sempre de polaridade contrária
Alta estabilidade
GRUPO ESTRUTURA DO
MODO
FUNCIONAL GRUPO LIGADO
CH3
Dimetil silil Si
CH3
Fenil silil Si
MODO GRUPO ESTRUTURA DO
FUNCIONAL GRUPO LIGADO
Amino NH2
Ciano (nitrila) CN
FASE
NORMAL
Si O CH2 CH CH2OH
Diol O OH
Si O CH2 CH CH2OH
O OH
1. Si – OH + ROH Si – OR + H2O
2. Si – OH + R3SiCl Si – OSiR3 + HCl
3. Si – OH + SOCl2 Si – Cl + SO2
4. Si – Cl + RLi Si –R + LiCl
apolar
Fluxo
polar
polar
Hidrocarbonetos aromáticos,
óleos, esteróides, plásticos,
polímeros, alcalóides (C18)
Ácidosurinários, ácidos
carboxílicos, sulfonamidas,
hormônios tireóide,
azocorantes (C8)
Classificação baseada na Natureza das
Fases
NPC
Fase móvel Apolar ⇒ hexano, isooctano
Fase estacionária Polar ⇒ sílica, alumina
RPC
Fase móvel Polar ⇒ acetonitrila, metanol,
água
Fase estacionária Apolar ⇒ C8, C18
GERALMENTE:
Fluxo
+
SO 3 Na
A separação é baseada no tamanho da molécula e
não em fenômenos de interações físicas ou
químicas
Gel
Poro
Originalmente:
separação de materiais biológicos
fase móvel = aquosa
FILTRAÇÃO
fase estacionária = gel de
EM
dextran/epicloridrina GEL
Posteriormente:
separação de polímeros
Resolução (Rs)
Fator de Simetria
Formato Ideal do Pico (Gaussiana)
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de
gás de arraste)
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser
suficientemente elevada para que a amostra
vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição;
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da
temperatura de ebulição do componente
menos volátil;
VOLUME INJETADO Depende do tipo de
coluna e do estado físico da amostra. Típico:
poucos microlitros (amostra líquida em coluna
capilar)
Microsseringa de 10 µ L:
corpo (pirex)
Coluna
EMPACOTADA CAPILAR
(pouco usada) ∅ = 0,1 a 0,5 mm
∅ = 3 a 6 mm L = 5 m a 100 m
L = 0,5 m a 5 m Paredes internas recobertas
LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos
porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de
materiais inertes (colunas capilares)
FE
líquida
SUPORTE Tubo capilar de
Sólido inerte material inerte
poroso
Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização,
normalmente ela é:
GASES DE REFINARIA
Coluna:Carboxen-1000 60-80
mesh; 15’ x 1/8”
TCOL : 35oC a 225oC / 20oC. min-1
Gás de Arraste: He @ 30 ml.min-1
Detector: TCD
FE Líquidas: Partição
POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a
umidade e oxidação; ainda muito importantes.
Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais:
Carbowax,
Estrutura DB-Wax,
Química: Supelcowax,
H HP-Wax,
O CH 2 CH2 etc.)
OH
AMINAS ALIFÁTICAS
Coluna:4 % Carbowax
20M s/ Carbopack B +
0,8% KOH
TCOL : 200oC
(isotérmico) Gás de
Arraste: N2 @ 20
mL.min-1
Detector: FID
Amostra: 0,01
µ L da mistura de
aminas
Maior parte das aplicações em CG moderna
Quatro grandes grupos estruturais:
Filmes espessos de FE
líquida
Grande superfície líquida
ABSORÇÃO exposta ao gás de arraste
Su
17 min
3 min
Coluna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 µ
m)
TCOL :110 C (isotérmico)
o
50%
Ph
50%
Me
5% Ph
95%
Me
Colunas empacotadas
Tubo de material inerte recheado com FE sólida granulada
ou FE líquida depositada sobre suporte sólido.
aço inox
MATERIAL vidro pirex ø = 3 mm a 6 mm
DO níquel L = 0,5 m a 5 m
TUBO TEFLON
MESH dp
60 - 80 mesh 177 - 250 µ m
Granulometria
do 80 - 100 mesh 149 - 177 µ m
recheio 100 - 120 mesh 125 - 149 µ m
secagem
calcinação
Esqueletos fósseis fusão com soda
(SiO2 + óxidos lavagem com ácido
Chromosorb
silanização
metálicos) de algas Anachrom
microscópicas Supelcoport
...
COLUNAS EMPACOTADAS
FE Líquidas: Suporte
Chromosorb - características gerais
Densidade Aparente
Chromosorb P Róseo, muito ativo.
Tamanho de Poro
Chromosorb W Branco, mais inerte que o P.
Área Superficial
Chromosorb G Similar ao W, maior resistência mecânica
% M áx. de FE
de inércia
crescente
Ordem
2 -1 -1
NOME m .g g.ml µm
A DA COLUNA
TEMPERATUR
CONTROLE CONFIÁVEL DA
TEMPERATURA DA COLUNA É
Forno da coluna
Características Desejáveis de um
•AMPLA
Forno: FAIXA DE TEMPERATURA
DE USO Pelo menos de Tambiente até
400oC. Sistemas criogênicos (T <
Tambiente ) podem ser necessários em
casos especiais.
•TEMPERATURA INDEPENDENTE
DOS DEMAIS MÓDULOS Não deve
ser afetado pela temperatura do
TCOL BAIXA:
- Componentes mais voláteis são
separados
- Componentes menos volá-teis
demoram a eluir, saindo como
picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis
não são separados
- Componentes menos voláteis
eluem mais rapidamente
Programação linear de
Temperatura de coluna
Consegue-se boa
separação dos
componentes da
amostra em
menor
Parâmetros de uma programação de tempo
temperatura:
TINI
tFIM Tempo Final do Programa
tINI tFIM
R Velocidade de Aquecimento TEMPO
Detectores
Dispositivos que examinam
continuamente o material que sai da
coluna, gerando sinal quando da
passagem de substâncias que não o gás
de arraste
RUÍDO (N)
AR
FLAME TIP
H2
BLOCO
COLUNA
Uma diferença de potencial elétrico é
O ar e o H2 difundem para o interior
aplicada entre o flame tip e o coletor
do coletor, onde se misturam ao
- quando se formam íons na chama,
efluente da coluna e queimam:
flui uma corrente elétrica:
Compostos que NÃO produzem resposta no DIC:
Gases nobres NH3, NxOy
Na passagem de uma
substância eletrofílica alguns
eletrons são absorvidos,
resultando uma supressão
de corrente elétrica.
2 1
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência
HPLC Moderna Reservatórios para
Injetor os solventes
Pré-coluna
Bomba HPLC
Coluna Analítica
Sistema de Tratamento
Detector
de Dados
Filtro em linha Scavenger
Velocidade fluxo
0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas
> 5,0 mL/min para colunas preparativas
Pressão operação
500-2000 psi para colunas analíticas
Entrada
Filtros
Tubo
Recheio
Filtro
Saída
Serve para proteger a coluna de
separação.
Fase e diâmetro iguais aos da coluna
de separação.
10-20% do comprimento da coluna de
separação
ISOCRÁTICA = a composição da fase
móvel não muda durante a corrida.
1 30
Solvatante Baixa pressão de vapor
Banho de ultrassom
Filtração a vácuo
Borbulhamento de gás inerte
Solvente de base
Força de
Água / tampão eluição
Solventes moduladores
Metanol
Acetonitrila
THF
Solvente de base
Força de
eluição
n-hexano
Solventes moduladores
Clorofórmio
Acetato de etila
Metanol
Equipamento com uma pequena célula de
fluxo conectado na saída da coluna e que
monitora a concentração dos analitos.
ESPECIFICIDADE
• Aumenta com a sensibilidade
Amostra: 50 µ l,
quantidades
indicadas ao lado
Coluna: SB-C18
4,6 x 75 mm
3,5 µ m
Fase Móvel: 70 mM KH2PO4
1 mM
EDTA/ACN:água
97/3 pH 4,5;
Fluxo: 1,5
ml/min;
Temperatura: ambiente
Detetor: Eletroquímico
Fluorescencia.
Pode-se efetuar análises qualitativas
e quantitativas com rapidez
. .
A + B – C+ A – B+ + C
B+ + C B + C+ A+ + A + B+
B
Partículasda fase estacionária
extremamente pequenas (diâmetro <
10 µ m) ⇒ bombas para operações a
altas pressões (até 2000 psi) e baixas
vazões (0,1 a 10 mL / min)
Solventes especiais e ultra-puros
Detectores seletivos e super-
sensíveis, com tamanho de célula de
detecção < 10 µ L
Vantagens da HPLC:
Alta resolução
resolve (separa) até centenas de componentes
em amostras complexas
Detecção de alta sensibilidade
detecta até nos limites de pg - ng
Análises rápidas e precisas
análises de 1 - 60 min, precisão de 1% RSD
Análises automatizadas
usando injetor automático e sistema de
tratamento de dados
Substâncias químicas
• Pouco voláteis
• Polares ou iônica
• Macromoléculas
• Termicamente instáveis
• Enancioméricas
• Biomoléculas
PM < 1.000
Insolúvel Solúvel
água água
Solúvel Solúvel
PM > 1.000 hexano metanol Não-iônica Iônica
Amostra Amostra
não-aquosa aquosa
Biopolímeros
solúveis água
Condições
Polímeros Condições
desnaturantes
insolúveis água não-desnaturantes
(separação analítica)
Preparativa
Preparativa
Informação tamanho
SA
%A = x100
S
Onde SA é a área do pico correspondente
à substância A e S é a área total do
cromatograma.
VANTAGENS DESVANTAGENS
Cx
= 1,286
C PI
C x = 1,286C PI = 1,286 x 2 = 2,573 ppm