Planejamento, Execuo e Interpretao de Ensaios de Bioequivalncia

ndice
Definies Objetivo do Estudo de BE Tipo de Estudo de BE Desenho do Estudo de BE Tamanho da Amostra Planejamento e Organizao de Estudos de BE
Etapa Clnica Etapa Analtica Etapa Estatstica

Ensaios de Biodisponibilidade (BD) Estrutura de Protocolo e Relatrio de Estudo de BE Exemplo de Estudo de BE

Referncias Bibliogrficas

Definies

Medicamento
FRMACO EXCIPIENTES

Indivduo

LIBERAO ABSORO STIO DE AO

TECNOLOGIA DE

PRODUO

FORMA FARMACUTICA

EFICCIA TERAPUTICA

Biodisponibilidade Comparada
C
Biodisponibilidade absoluta comparao entre as concentraes sanguneas de uma droga por via extravascular aos valores da mesma droga administrada por via intravenosa.
VO Estudo de um novo medicamento IV

t
Biodisponibilidade relativa comparao entre dois produtos (Teste e Referncia), administrados pela mesma via. Comparao de 02 FF ou
mudana de formulao, comercializao de medicamentos genricos.

Bioequivalncia
C
um estudo comparativo entre as biodisponibilidades de dois medicamentos que possuem a mesma indicao teraputica e que so administrados pela mesma via extravascular.

Cmax Cmax

AUC AUC
t

tmaxtmax

Medicamentos Bioequivalentes
RDC n.16 (Brasil, 2007) define medicamentos bioequivalentes como EQUIVALENTES FARMACUTICOS que, ao serem administrados na mesma dose molar, nas mesmas condies experimentais, no apresentam diferenas estatisticamente significativas em relao biodisponibilidade. Excluindo as alternativas farmacuticas do conceito de bioequivalncia.

EQUIVALENTE TERAPUTICO

Medicamentos farmacuticamente equivalentes, e que aps administrao, na mesma dose molar, seus efeitos em relao eficcia e segurana so necessariamente semelhantes

A BIODISPONIBILIDADE PASSA A SER ASSOCIADA DIRETAMENTE A QUALIDADE DO MEDICAMENTO.

Equivalente Farmacutico
RDC n.16 (Brasil, 2007)
so medicamentos que contm o mesmo frmaco, isto , mesmo sal ou ster da mesma molcula terapeuticamente ativa, na mesma quantidade e forma farmacutica, podendo ou no conter excipientes idnticos. Devem cumprir com as mesmas especificaes atualizadas da Farmacopia Brasileira e, na ausncia destas, com as de outros cdigos autorizados pela legislao vigente ou, ainda, com outros padres aplicveis de qualidade, relacionados identidade, dosagem, pureza, potncia, uniformidade de contedo, tempo de desintegrao e velocidade de dissoluo, quando for o caso.

Alternativa Farmacutica

So medicamentos que contm a mesma molcula terapeuticamente ativa, ou seu precursor, mas no necessariamente na mesma quantidade, forma farmacutica, sal ou ster.

Objetivo do estudo
No ensaio de bioequivalncia pretende-se comparar a biodisponibilidade do produto Teste, administrado por via extravascular, biodisponibilidade do produto Referncia, tambm administrado por via extravascular.

Tipo de Estudo
A bioequivalncia entre produtos farmacuticos pode ser determinada por meio de mtodos in vitro ou in vivo.

A seleo do mais adequado depende de:

objetivo mtodos natureza

do estudo;

analticos disponveis;

do produto farmacutico.

Tipo de Estudo
Segundo FDA, o ensaio deve ser conduzido utilizando-se o mtodo mais exato, preciso e reprodutvel:

ensaio in vivo em seres humanos com determinao da concentrao do frmaco em fluidos biolgicos ou ensaio in vivo em animais com correlao; ensaio in vivo em seres humanos com determinao da excreo urinria do frmaco; ensaio in vivo em seres humanos com determinao de efeito farmacolgico agudo; ensaio clnico controlado; ensaio in vitro.

Tipo de Estudo
In vitro In vivo
Farmacocintico Farmacodinmico efeito farmacodinmico susp. Oftlmicas, inalatrios de ao local, sprays nasais, etc. Clnico Eficcia Segurana farmacocintico ou farmacodinmico

Desenho do Estudo
Estudo Clnico
Controlado grupos controle e experimental Experimental questes ticas

Prospectivo comparao efeito e valor da interveno com controle em seres humanos.

Randomizado deciso aleatria

Tipo de Estudo
GRUPO CONTROLE Tratamento padro ou ativo para doena ou outra finalidade e em alguns casos pode ser o placebo. Novo produto x tratamento convencional Novo produto x placebo Teste x referncia TxRxP T x R x CA x P PLACEBO Avaliar eficcia do tratamento

Desenho do Estudo
Simples todos os voluntrios recebem o mesmo tratamento Mais de um grupo paralelo ou cruzado, vlt randomizados recebem diferentes tratamentos Cruzado Paralelo
Aberto Cego ou mascaramento (blinding) Duplo cego

Desenho do Estudo
Cruzado (Cross-over)
Grupos recebem mais de um tratamento Cada indivduo funciona como seu controle Aumento do poder Reduo do tamanho da amostra Efeito residual amenizado pelo washout

Paralelo
Cada grupo recebe um tratamento Doenas crnicas Comparao entre grupos Reduo do poder devido a diferenas no tratamento Aumento tamanho da amostra (variabilidade dos indivduos do estado inicial e sua resposta) No h efeito residual

Desenho do Estudo
Randomizao
Vantagens:
Grupos com caractersticas semelhantes; Reduz vis (seleo e confuso); Determinantes conhecidos e desconhecidos sejam distribudos de forma semelhante entre os grupos (independente do tamanho da amostra)

Desenho do Estudo
Estudo Paralelo, randomizado
Tratamento A

T + P e AC

Tratamento

B R + P e AC

voluntrios
Tratamento

C P + P e AC

Tratamento

D P e AC

T = medicamento Teste na forma de spray ou aerossol; R = medicamento Referncia na forma de spray ou aerossol; P = Placebo na forma de spray ou aerosol; AC = Ativo controle.

Desenho do Estudo
Estudo Cruzado, randomizado
Tratamento

A washout

Tratamento

Amostra

Tratamento

Tratamento

Desenho do Estudo
O planejamento adequado do experimento deve ter como objetivo minimizar a variabilidade que pode advir de vrias fontes:
Inter-individual Intra-individual Efeito de perodos, ao residual de tratamento antecedente Erro experimental Variabilidade associada a tratamentos diferentes, como administrao de produtos ou dosagens diferentes

Desenho do Estudo
Fonte de Vieses em potencial
Processo seleo dos grupos; A alocao do tratamento;

RANDOMIZAO

AVALIAO CEGA

Forma de realizao da interveno; Aferio dos resultados.

Desenho do Estudo
Os ensaios de bioequivalncia so, em geral, do tipo aberto, cruzado e aleatrio. Neste esquema, na comparao entre dois produtos, teremos:
dois

grupos; fases;

duas

perodo

para eliminao do frmaco do organismo- washout.

Desenho do Estudo
Nmero de Perodos e Seqncias

Nmero de formulaes a serem comparadas Caractersticas do frmaco e sua BD Objetivo do estudo ...

Desenho do Estudo
Estudo Bioequivalncia aberto, crossover 2x2, randomizado
Perodo 1 Perodo 2

Sequncia 1 (RT)

Referncia (R)

Teste (T)

Sequncia 2 (TR)

Teste (T)

Referncia (R)

Desenho do Estudo
Quadrado Latino
Delineamento cruzado 2x3 Delineamento cruzado 2x2

F. I F. I 1 2 R T F. II 1 T 2 R T1 R

F. II T2 R

F.III

T1
T2

Desenho do Estudo
A administrao dos produtos, em geral, feita em dose nica, mas existem situaes em que se faz necessria a administrao em doses mltiplas:

mtodo analtico pouco sensvel; formas farmacuticas de liberao modificada;

farmacocintica dose-dependente;
grande variabilidade intra ou inter-individual; impossibilidade de utilizao de voluntrios sadios; impossibilidade de definir com exatido o valor de kel; produtos com mesma extenso, mas diferentes velocidades de absoro.

Tamanho da amostra
Qual o principal objetivo do estudo?

Qual a principal medida de resultado? Como os dados sero analisados para que seja detectada uma diferena de tratamento? Qual a menor diferena de tratamento considerada importante para ser detectada e com que grau de preciso?

Tamanho da amostra
Poder do teste
Probabilidade de aceitar a BE entre produto teste e referncia corretamente.
Poder desejado 80% (dentro dos limites clinicamente importantes, 20% da mdia do referncia)

Coeficiente de variao intra-individual da droga

Literatura Estudo piloto

Tamanho da amostra
O nmero de voluntrios no ensaio deve ser suficiente para garantir a obteno de resultados estatisticamente significativos, mas a utilizao de amostra excessivamente grande no eticamente recomendvel.

EMEA: mnimo 12 voluntrios;

FDA: mnimo 24 voluntrios;

ANVS: mnimo 24 voluntrios. No sendo permitida utilizao de nmero inferior a 12.

PACIENTES OU VOLUNTRIOS

Planejamento e Organizao de Estudos de Bioequivalncia

Bioequivalncia

Clnica
Protocolo
voluntrios dieta amostragem

Analtica
Amostras
Recepo Cadastro Armazenamento

Estatstica
Clculos de bioequivalncia

Relatrio final Comit de tica Quantificao

Internao

Descarte

Planejamento e Organizao de Estudos de Bioequivalncia

Equivalncia Farmacutica diferena de teor (R/T) de 5%.

Guia para realizao do estudo e elaborao do relatrio de equivalncia farmacutica e perfil de dissoluo.

Fase Clnica
CEP (Comit de tica em Pesquisa)

Cronograma de coletas (tempo maior ou igual a 3-5 meias-vidas de eliminao)

Tempo de Washout (tempo maior ou igual a 7 meias-vidas de eliminao) Seleo de voluntrios sadios (critrios, sexo, mnimo de 12 voluntrios) Desenho do estudo aberto, aleatrio e cruzado Forma de coleta, processamento, armazenamento e transporte das amostras

BPC

Fase Clnica
Seleo dos voluntrios
Critrios de incluso:

voluntrios sadios;

18 a 50 anos;
Consentimento livre e esclarecido; peso ideal 15 %. Contraceptivos 10%; Submetido a avaliao clnica e considerado saudvel; Apresenta um balano biolgico cujo resultado est nos limites do normal ou clinicamente aceitveis para um indivduo sadio; No apresenta hbitos alimentares julgados particulares pelo investigador.

Fase Clnica
Seleo dos voluntrios
Critrios de excluso:

fumo; abuso de drogas e lcool; Exames complementares fora dos valores normais; condies patolgicas - AIDS, hepatite; Participao em outro estudo nos ltimos 3 meses; Uso medicao regular nas ltimas 4 semanas ou qualquer medicao 1 semana antes deste estudo; Internao na ltimas 8 semanas ;

Doao de sangue nos ltimos 3 meses

O voluntrio tem qualquer condio que o impede de participar do estudo pelo julgamento do investigador; Gravidez.

Fase Clnica
Padronizao do ensaio
O ensaio deve ser realizado em condies padronizadas, visando minimizao da variabilidade:

administrao em jejum;
volume padronizado de gua; refeies padronizadas;

absteno de outros medicamentos;

absteno de bebidas e alimentos que possam exercer influncia nas funes renal, heptica, gastrintestinal e circulatria; esforo fsico.

Fase Clnica
Coleta de amostras biolgicas
Ensaios que envolvem determinao das curvas de concentrao sangnea:
intervalos

adequados para permitir estimativa da concentrao sangnea mxima;

de, no mnimo, 3-5 vezes a meia-vida de eliminao; entre coletas no deve ser superior meia-vida de eliminao.

perodo

intervalo

Fase Clnica
Coleta de amostras biolgicas
Ensaios realizados em urina: freqncia suficiente para permitir estimativa da velocidade e da extenso de eliminao.

Fase Analtica
Desenvolvimento e validao do mtodo - especfico para cada analito

Aplicao anlise de amostras de concentrao desconhecida

BPL

Fase Analtica
Anlise das amostras biolgicas
Mtodos utilizados:
HPLC; GC; RIE;

ELISA.

Fase Analtica
Anlise das amostras biolgicas
CLAE com deteco:
Ultravioleta (mais utilizada) Fluorescncia Espectrometria de massa (LC-MS e LC-MS/MS)
Aumento do emprego na rotina bioanaltica Alta sensibilidade, seletividade, preciso, exatido e rapidez

CL EM/EM

Fase Analtica
Anlise das amostras biolgicas
H.P.L.C.-UV

H.P.L.C. acoplado a MS/MS

G.C. acoplado a MS.

Fase Estatstica
Determinao do nmero de voluntrios Desenho do estudo lista de randomizao
Perodo 1 Perodo 2

Sequncia 1 (RT)

Referncia (R)

Teste (T)

Sequncia 2 (TR)

Teste (T)

Referncia (R)

Parmetros farmacocinticos e tratamento dos dados

Fase Estatstica
Parmetros Farmacocinticos
Os parmetros farmacocinticos geralmente utilizados em ensaios de bioequivalncia so:
AUCT

ou AUC;

Cmax;
tmax; Xu; dXu/dtmax.

Fase Estatstica
Curva concentrao plasmtica x tempo Diretos Indiretos 8

Cmax
Concentrao

6
Ke

4 2 0 0

AUC0-t h
Tmax
3 6
Tempo (h)

T1/2 = 0,693
Ke

12

Fase Estatstica
Curva excreo urinria x tempo

Xu Xu

Fase Estatstica
Curva velocidade de excreo urinria x tempo
dXu/dt dXu/dtmax

tmax

Fase Estatstica
Anlise Estatstica
O objetivo da anlise estatstica em ensaios de bioequivalncia verificar se a biodisponibilidade do produto teste suficientemente semelhante do referncia, de forma que estes possam ser considerados bioequivalentes.

Assim, atualmente, consideram-se como mais adequados, os procedimentos baseados na determinao de intervalos de confiana.

Fase Estatstica
Anlise Estatstica

anlise univariada (teste t pareado e teste de Wilcoxon) para Tmax;

anlise multivariada (ANOVA) para Cmax, tmax e AUC0-t nas escalas original e logartmica;

determinao do intervalo de confiana 90 % (I.C. 90 %) para as relaes entre Cmax e AUC0-t dos produtos teste e referncia, na escala logartmica.

Fase Estatstica
Anlise Estatstica
Dois medicamentos sero considerados bioequivalentes quando o IC de 90% para as seguintes razes: C max T 80% Cmax teste 125% Cmax max R C referncia
ASC 0-t teste AUCTT ASC 0-t referncia

80%

AUCTR

125%

entre as mdias dos parmetros farmacocinticos (logaritmicamente convertidos) do teste e referncia estiverem compreendidos entre 80-125%

Ensaios de Biodisponibilidade

Objetivo do ensaio; Desenho do ensaio; Tamanho da amostra; Seleo dos voluntrios; Padronizao do ensaio; Coleta de amostras biolgicas; Anlise das amostras biolgicas; Parmetros farmacocinticos; Clculos.

Objetivo do ensaio
No ensaio de biodisponibilidade pretende-se determinar a biodisponibilidade absoluta de um frmaco a partir de uma forma farmacutica. Assim, o ensaio de biodisponibilidade compara o produto Teste, administrado por via extravascular, ao produto Referncia, administrado por via intra-vascular.

Tamanho da amostra
ANVS: mnimo 12 voluntrios, sexo masculino.

Clculos
A biodisponibilidade absoluta (F) corresponde frao da dose administrada efetivamente absorvida.

AUCTT DoseR F (%) 100 AUCTR DoseT

RE n894, de 29 de maio de 2003 Guia para Elaborao de Protocolo de Estudo de Biodisponibilidade Relativa/ Bioequivalncia

Estrutura do Protocolo
1. Ttulo do Projeto 2. Nmero e data do protocolo 3. Investigador principal 4. Investigador clnico 5. Responsvel pela etapa analtica 6. Responsvel pela etapa estatstica 7. Instalaes (nome e endereo) 8. Objetivo do estudo 9. Delineamento do estudo 10. Populao do estudo 11. Reaes adversas 12. Consideraes ticas; 13. Mtodo analtico 14. Tratamento Estatstico 15. Desvios de protocolo 16. Apndices

Determination of ampicillin in human plasma by SPE-LC-MS/MS and its use in bioequivalence studies.
Exemplo -

Ampicilina - ABPC
CARACTERSTICAS FSICOQUMICAS D(-) alfa aminobenzilpenicilina
(ABPC)

CARACTERSTICAS FARMACOCINTICAS Absoro oral de 30-54%, aumentada

sulbactam (88.7%) e c. clavulnico Cmax 2.5-5.0 g/mL (500mg)

Grupo amino ionizvel

P cristalino, branco FM C16H19N3O4S PM 349.4

Cmax 7- 8 g/mL (1g)

Tmax = 1- 2 h T = 1.0 1.5 h, dose usual da ABPC 500mg Apenas 10% da droga metabolozada Depurada nos rins (50-60%), 25-60% forma inalterada 20% da ABPC liga-se s protenas plasmticas

Solvel em gua

CARACTERSTICAS FARMACODINMICAS
Antibitico aminopenicilnico Infeces das vias respiratrias superiores com amplo espectro Gram +e naseas, vmito, erupo cutnea maculopapular

Experimental - Mtodo analtico para determinao de ABPC

HPLC-MS/MS (Shimadzu/ Micromass) Extrao: SPE Cartuchos: HLB 1cc 30mg (Oasis]) Coluna analtica: Chromolith Speed ROD RP-18e (50x4.6 mm) Temperatura do forno: 30C Fase mvel: Acetonitrila (0.1% c. frmico) + gua (0.1% c. Frmico) 80:20, v/v. Taxa de fluxo: 0.8 mL/min Split: 6-1 Padro interno: Amoxicilina Tempos de reteno: 1.15 min (Ampicilina) 1.15 min (P.I. Amoxicilina) Tempo de corrida: 2.5 min Deteco: MS/MS modo MRM

Experimental - Mtodo analtico para determinao de ABPC

MS/MS Fonte de ons: Electrospray (ESI)+ Sistema: QUATRO LC Aquisio de ons: MRM Voltagem do capilar: 2.75 kV Voltagem do cone amostragem: 10 V Voltagem do cone extrator: 3 V Temperatura fonte: 110C Energia de coliso (Ecol): 12 eV Gs de coliso: Argnio m/z Ampicilina 350.10 > 106.04 m/z Amoxicilina (PI) 366.06 > 207.88 Dwell: 0.5 s Programa: Masslynx v. 3.5 (Micromas)

Experimental - Mtodo analtico para determinao de ABPC Procedimento de EFS

Agitao 10s

Agitao 10s

250 L plasma

2
S S

3
S
S S Analytical Column

APLICAO DO MTODO Estudo de Biodisponibilidae Relativa da ABPC cpsulas 500mg

Casustica
n=23 homens; idade e peso mdios: 24 anos e 70 kg;

no fumantes;
ausncia de patologias cardacas, renais, gastrintestinais, neurolgicas e metablicas; sem antecedentes de hipersensibilidade a medicamentos; resultados normais em exames laboratoriais.
Medicamento Referncia (R) Amplacilina da EUROFARMA Medicamento Teste (T) Ampicilina cpsulas 500mg

APLICAO DO MTODO Estudo de Biodisponibilidae Relativa da ABPC cpsulas 500mg

Procedimento

ensaio aleatrio, cruzado, formando-se dois grupos de voluntrios (A e B) e realizado em duas fases (I e II) intercaladas por perodo de 7 dias;

Dose 1 grama
I A B R T II T R

administrao dos produtos pela manh, aps jejum de uma noite, com 200 mL de gua; Caf da manh e almoo padronizados 3 e 6 horas aps administrao; absteno de bebidas alcolicas, caf e outras contendo xantinas 48 horas antes do ensaio e durante a sua realizao; absteno de medicamentos uma semana antes do ensaio e durante sua realizao.

APLICAO DO MTODO Estudo de Biodisponibilidae Relativa da ABPC cpsulas 500mg

Coleta de amostras
amostras de sangue; Cronograma de coleta (15 pontos): 0.00, 0.50, 0.75, 1.00, 1.50, 1.75, 2.00, 2.50, 3.00, 4.00, 5.00 6.00, 7.00, 8.00 e 12.00 horas obteno do plasma, armazenado a -70C.

Parmetros Farmacocinticos
Cmax; tmax; AUCT; t(1/2)el;

kel.

RESULTADOS Validao

Parmetro Especificidade Recuperao mdia Linearidade R2 LIQ Preciso intra-ensaio Exatido intra-ensaio Preciso inter-ensaio Exatido inter-ensaio

Resultado Ausncia de interferentes 94.38% 0.1 15 g/mL 0.99 0.10 g/mL 8.5% 92.7 106.0 % 10.8% 90.7-103.2 %

RESULTADOS Validao
Compound 1 name: Ampicilina Method File: 10_08_04_NUD_02_04_valid_02 Coefficient of Determination: 0.999395 Calibration curve: 0.425153 * x + 0.0105210 Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 6.39

Response

0 0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

14.0

ug/ml 15.0

Figura 1 Grfico da Linearidade (n=3)

Equao da Curva Mdia de Calibrao: y = 0,425153x 0.0105210 Peso: 1/x R2= 0.999395

RESULTADOS Estudo de Biodisponibilidade Relativa da ABPC cpsulas de 500mg

Curva mdia de decaimento plasmtico da AMP (n=23) 7.00

concentrao ug/mL

6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
Referncia Teste

tempo (h)

Figura 4. Curva mdia da concentrao plasmtica de AMP de 23 voluntrios sadios que participaram do estudo de bioequivalncia entre os produtos AMPICILINA (medicamento teste) e AMPLACILINA (medicamento referncia) vs tempo (h).

RESULTADOS Estudo de Biodisponibilidade Relativa da ABPC cpsulas de 500mg

Tabela. Mdia dos parmetros farmacocinticos obtidos aps administrao oral de cpsulas de 500mh de AMP em voluntrios sadios

AMPICILINA (Teste)

AMPLACILINA (Referncia)

Cmax (g/mL)
AUC AUC
0-12h (g/mL.h)

6,85 1,97
20,49 5,29 20,86 5,37 2,26 1,11

7,11

2,08

22,38 6,00 22,71 6,09 1,93 0,54 1,01 0,21

0- (g/mL.h)

Tmax (h) T1/2 (h)

1,01 0,13

Referncias Bibliogrficas
ANVISA RE n 1170, de 19/04/06 : Guia para provas de biodisponibilidade relativa/ bioequivalncia de medicamentos; ANVISA RE n894, de 29/05/03: Guia para elaborao de protocolo de estudo de biodisponibilidade realtiva/ bioequivalncia ANVISA RE n 898, 29/05/03: Guia para planejamento e realizao da etapa estatstica de estudos de biodisponibilidade relativa/ bioequivalncia; ANVISA RE n 899, 29/05/03: Guia para a validao de mtodos analticos e bioanalticos; ANVISA - RDC n 133, de 29/05/03: Regulamento Tcnico para medicamento similar. ANVISA - RDC n 135, de 29/05/03: Regulamento Tcnico para medicamentos genricos.