TERAPIA GENICA

Qu es?
La terapia gnica es una nueva forma de tratamiento de las enfermedades que se basa en la introduccin en las clulas material gentico (genes y otro tipo de cidos nucleicos) para corregir un problema biolgico.

TERAPIA GENICA SOMATICA

TERAPIA GENICA GERMINAL

Cules son los objetivos?

- Reparar los errores que existen en un gen - Complementar o sustituir el defecto en la funcin de un gen defectuoso introduciendo otra copia normal de ste en las clulas. - Inhibir o bloquear el funcionamiento de aquellos genes cuya intervencin contribuye al desarrollo de una enfermedad. - Introducir la informacin que permita a la clula sintetizar una protena que tenga un efecto teraputico nuevo.

METODOS DE APLICACION
TERAPIA EX VIVO TERAPIA IN VIVO TERPIA IN SITU

COMPARACION DE LA TERAPIA GENICA IN VIVO

Se transfiere directamente el gen al tejido afectado. No es factible hacer una prueba previa de su eficiencia . El resultado es menos eficiente.

EX VIVO
Se transfiere el gen a clulas en cultivo para hacer despus el transplante. Antes del transplante se puede probar su eficiencia. La transferencia gnica es ptima, por lo menos en el cultivo

ESTRATEGIAS DE LA TERAPIA GENICA

INSERCION GENICA (aumento gentico)

CORRECCION DIRIGIDA DE MUTACIONES

SUPRESION DIRIGIDA DE CELULAS ESPECIFICAS (genes suicidas o estimuladores de respuesta inmune)

Las estrategias de manipulacin gentica con finalidad teraputica las podemos clasificar en tres grupos.
1) Adicin gnica. Esta aproximacin se basa en introducir una copia correcta del gen funcional que d lugar a la expresin de la protena diana en el tejido adecuado y con niveles suficientes para que pueda desarrollar su funcin de forma apropiada. Esta estrategia es la ms ampliamente utilizada y puede aplicarse a la mayora de enfermedades humanas. 2) Supresin gnica. En este caso el objetivo final es anular o reducir la expresin de un determinado gen.. Recientemente se ha descrito una nueva tecnologa que consigue de forma muy eficaz reducir la expresin de un gen concreto y se conoce como interferencia del RNA.

3) Correccin gnica. En esta estrategia lo que se busca es corregir el gen alterado por el gen correcto.
Ms recientemente ha surgido una nueva estrategia que permite el intercambio del nucletido especfico mutado (unidad defectuosa de la secuencia gnica) por el nucletido apropiado dando lugar as a una copia correcta del gen.

Esta estrategia puede ser muy interesante para la correccin de Enfermedades monognicas, donde mutaciones puntuales en un nico gen son las responsables de la enfermedad.

CONDICIONES DE APLICABILIDAD DE LA TERAPIA GENICA

TIPO DE HERENCIA PATRON DE HERENCIA NATURALEZA DE LA MUTACION CONTROL DE LA EXPRESION GENICA TAMAO DEL ADN CODIFICANTE DEL GEN A INSERTAR FACILIDAD DE EXTRAER Y CULTIVAR LAS CELULAS IN VITRO

Cules son los problemas?

- La transferencia de los genes a las clulas apropiadas y su posterior expresin. - La eleccin de la clula blanco de la transferencia gnica. Entre las clulas ms frecuentemente utilizadas destacan los fibroblastos de la piel y los linfocitos infiltrantes en tejidos y, como rgano diana, el hgado. - Resultados inconsistentes - Extrapolacin (de ratn a humano) - Produccin de vectores - No pasar a la investigacin clnica antes de tener resueltos en el mayor grado posible los problemas de investigacin

Cules son los frmacos de la terapia gnica?

Secuencias

codificadoras de protenas (gen normal etc) RNA interferente Sondas antisentido, Triples ADN Ribozimas

Cules son las herramientas?

El material gentico (el principio activo) Los vehculos o vectores

TERAPIA GNICA
VECTOR: Es aquel medio transportador que nos permitir insertar el material gentico de inters en las clulas del paciente en cuestin. Viral:
TIPO DE VECTORES

adeno, herpes, retro

No viral:

liposoma transferencia de genes receptores inyecciones de DNA

mediante

desnudo

El vector ideal sera aquel:

Que permita la incorporacin y expresin regulada durante el tiempo conveniente de uno o mas genes necesarios para la aplicacin clnica requerida. Que sea especifico en su transferencia gnica para la clula diana. Que sea irreconocible por el sistema inmune y no inducir respuesta inflamatoria Que sea estable y fcil de obtener.

Mtodos para introducir y expresar genes en las clulas

-

Permiten solo la expresin transitoria de los genes

Mtodos qumicos que emplean la formacin de complejos de DNA con distintas sustancias - como liposomas (lipofeccin) - conjugados sintticos asociados a receptores (transferencia dirigida por receptores)

- fosfato clcico (transfeccin)

- mtodos fsicos que utilizan diversas tcnicas como corrientes elctricas (electroporacin) o inyeccin directa (balstica).

- Mtodos que permiten la expresin permanente. Distintos tipos de virus asociados a adenovirus o herpes

Tabla 1. Mtodos fsico-qumicos de transferencia gnica.

Microinyeccin Precipitacin con fosfato clcico Electroporacin Bombardeo con microproyectiles Inyeccin directa de ADN desnudo Conjugados ADN-protenas Conjugados ADN-adenovirus Liposomas

Vectores no virales :
-

Liposoma: Tamao ilimitado, no respuesta inmune al no tener protenas Desventaja: poca eficacia, tcnica in vivo e in situ El DNA desnudo, su limite es la exposicin de la lesin a este DNA, se ha hecho con aplicacin de campos elctricos, asociado a partculas de alta velocidad o a molculas policationicas

Esquema donde se muestra diverso tipos de lipidos catinicos utilizados como vectores en la Terapia Gnica

TRANSFERENCIA DE GENES MEDIANTE RECEPTORES: En este caso el ADN a insertar se le adiciona un ligante (molculas reconocidas por receptores especficos/tipo celular elegido) y un fusigeno para evitar su degradacin por el lisosoma celular. ADN + ligantes
clula

ADN penetra X endocitosis

L R

unin endosoma + lisosoma evitada por fusigenos

L

ADN entra al ncleo durante la divisin celular

TRANSFERENCIA DE GENES MEDIANTE RECEPTORES se emplea en: El tratamiento de la hipercolesterolemia

problema de hipercolesterolemia: gen codificador de receptores LDL ADN a insertar: Codificador de receptores para LDL ligando: ASOR-PL (Asialoorosmucoide - Polilisina) Receptor ASGPr : Especfico para hepatocitos
ASOR-PL ADN

Asialoglicoproteina

ASGPr

Nota: Este mtodo a diferencia del liposoma va dirigido contra una clula especfica por medio del reconocimiento ligando/receptor.

Por este mtodo el ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente es directamente inyectado dentro del tejido deseado.
INYECCIONES DE DNA DESNUDO: BOMBARDEO DE PARTCULAS DE ORO:

plsmido de ADN revestido gotas de oro o tungsteno. 2 Estas partculas son aceleradas por una descarga elctrica y son " disparadas" hacia el tejido.
1

Utilizado en: inyeccin directa del gen que codifica la protena de matriz del virus influenza, en el msculo,

Vectores vricos
Son virus recombinantes. Los mas frecuentes son los retrovirus y adenovirus, virus asociados a adenovirus , herpes simples y VIH.

VECTORES VIRALES PARA LA TERAPIA GENICA

Retrovirus Estructura Tamao insertado Clula blanco RNA 7.8 Kbp Clula en replicacin Al azar Adenovirus DNA 10 Kbp Cualquiera No se integra Efectivo en varios tejidos Adenoasociados DNA 5.2 Kbp Cualquiera En el cromosoma 19 y 13 Util en clulas de epitelio bronquial

Integracin

Transferencia No hay in vivo reportes para piel

Procedimiento:
Se modifica un retrovirus de modo que solo pueda sintetizar la capside. Paralelamente se fabrica artificialmente un retrovirus que contenga el gen que queremos introducir pero sin capside

Se incuban ambos retrovirus para obtener el retrovirus deseado que no es infeccioso, pero que contiene un gen exgeno que se puede insertar. Hoy en da existen retrovirus con secuencias promotoras especificas que hacen que dicho retrovirus se exprese solo en el tejido deseado. Tambin se puede conseguir que la cpside del retrovirus exprese protenas solo reconocidas por receptores especficos del tejido

Adenovirus:
Hasta 7,5 kpb, clulas que no se dividen (por ejemplo, el cerebro), No hay integracin del ADN teraputico Duracin limitada: semanas-meses, no riesgo de mutacin Tcnica in vivo

Ventajas:

Eficiente multiplicacin No se integran en el genoma Se pueden insertar en clulas que no se estn dividiendo Desventajas.

Su limitacin es el tiempo Falta de especificidad tisular Riesgo de infeccin Provoca respuesta inmune

Virus asociados a adenovirus. Son parvo virus que requieren la coinfeccin de un adenovirus para multiplicarse. Su inters radica en el hecho de que se integran especficamente en cierta regin del cromosoma 19.

Otros virus empleados han sido los herpes virus. Su complejidad y lo limitado aun de su conocimiento dificulta su utilizacin. Una ventaja de los herpes virus es el tamao del DNA que les permite incorporar no uno sino varios genes teraputicos. Adems son neurotrpicos. Los virus tipo VIH, tienen la ventaja de su especificidad en linfocitos CD 4 +.

TRANSFERENCIA GENICA
Los genes insertados se pueden llegar El gen se perpetua por a:
Integrar en los cromosomas de la clula
Terapia Exvivo en parte replicacin

mejora la seleccin

Quedar como elementos extracromosmicos (Episomas)

cromosmica Expresin estable a largo plazo Posibilidad de curar un transtorno gentico La insercin ocurre casi al azar Los genes pueden no expresarse La integracin puede provocar la muerte de la clula Riesgo de cncer (activacin de oncogenes) Como episomas pueden tener expresin elevada En algunos casos no hace falta expresin estable (eliminacin de clulas cancerosas) Si la clula estuvo en divisin puede no segregarse a las clulas hijas Harn falta tratamientos repetidos

MARCAJE CELULAR
Se introduce junto con el gen teraputico, uno o ms genes que permitan identificar y seleccionar las clulas que han incorporado el transgen Alternativa de doble marcaje con genes distintos de la secuencia de inters (aparicin de complicaciones)
Gen de la Timidina Kinasa del virus herpes simplex Ganciclovir P

Toxicidad

TERAPIA ANTISENTIDO
Oligonucletidos de DNA o RNA complementarios a secuencias gnicas especficas Interfieren con el flujo de la informacin gnica

CLASES PRINCIPALES

Secuencias antisentido Secuencias antign Ribosimas

Enfoques de la terapia antisentido

(Se unen a ARN HnRNA)

(Se hibridan al ADN generando secuencias de triple hlice) (RNAs antisentido, catalticos)

Administracin directa de oligonucletidos Expresin de los oligonucletidos (las clulas generarn los oligonucletidos antisentido)

ESTRATEGIAS EN LA TERAPIA GENICA DEL CANCER

1. Destruccin de las clulas tumorales
(expresin de productos txicos)
Gen de la Timidina Kinasa Gen de citosina desaminasa Gen de la Xantina Guanina Fosforribosil transferasa Gen de la citocromo P450 Gen de Nitroreductasas

2. Estimulacin de la respuesta inmune

Genes que generen productos altamente antignicos Genes del vacunas antgeno M de Histocom. I, II Genes de la beta 2 microglobulina Genes que codifican a linfoquinas en linfocitos TIL Induccin de la expresin de antgenos tumorales Gen de P53 Bloqueo del oncogen RAS Bloqueo del gen Bcl2 (antiapopttico) Bloqueo de la telomerasa con oligonucletidos Induccin del gen bax (proapottico)

3. Remisin del fenotipo de la clula cancerosa (inhibiendo

la expresin de oncogenes o aumentando genes supresores)

4.Proteccin de las clulas normales de la quimioterapia

Introduccin en clulas normales del gen MDR 1 p170 = Expulsar sustancias txicas.

Anticuerpo Monocl onal Factor de Crecimiento Estrgeno

Dominio Transmembrana

Anticuerpo Monoclonal

Actividad Tirosina Kinasa

RAS

Inhibidor de Kinasas Estrgeno

RAF

MEK

ERK
Antagonistas del Receptor de Estrgenos

Ciclina D1 CdK ER ER ER Blancos moleculares para la terapia y quimioprevencin del cncer de seno
Ciclo cel ul ar p21 Cip1 p21 Waf1 p27 Kip1 Fl avopiridol Staurosporina

FIGURA N 3.4

APLICACIONES DE LA TERAPIA GNICA

David, "nio burbuja", viviendo en su cmara estril para evitar cualquier riesgo de infeccin ya que su sistema inmune no produce defensas al tener una mutacin en el gen que codifica para la enzima adenosin desaminasa (Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3 ed.), Interamericana (1995)

Ashanti de Silva fue la primera paciente que recibi la terapia gnica ex vivo para combatir la inmunodeficiencia combinada severa (SCIDADA) cuando tena cuatro aos de edad. Pas de ser una "nia burbuja" a vivir con una calidad de vida normal. En la fotografa Ashanti tiene ya nueve aos. (Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).

Figura 1. Modelo de transferencia gnica in vivo mediado por liposomas catinicos: introduccin del gen que codifica el regulador transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR).

Figura 1. Modelo de transferencia gnica in vivo mediado por liposomas catinicos: introduccin del gen que codifica el regulador transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR).

Figura 2. Modelo de transferencia gnica ex vivo: introduccin del gen que codifica el receptor de LDL en el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar monognica.

Distrofia muscular de Duchenne:

Primera prueba clnica de la terapia gnica: 14 de septiembre de 1990 Hasta el ao 2000, ms de 3500 personas fueron tratadas con terapia gnica.

TERAPIA GNICA ENSAYOS 2001

VECTOR
ENSAYOS EJEMPLOS DE ENFERMEDADES SIENDO TRATADAS PRINCIPALMENTE DESORDENES NO GENTICOS

Retrovirus

157 Muchos cnceres, AIDS, Inmunodeficiencia combinada severa, artritis reumatoide, injertos vs enfermedades hospedero, esclersis mltiple, osteodisplasia, hemofilia 132 Muchos cnceres, enfermedad arterial perifrica, fibrosis cstica, enfermedad de Canavan 35 Muchos cnceres 7 Cncer de prstata, fibrosis cstica, hemofilia B 57 Muchos cnceres 47 Muchos cnceres, enfermedad arterial perifrica, enfermedad arterial coronaria, neuropata periferica, fracturas seas

Adenovirus

Pox virus Adeno virus asociados Lipofeccin ADN desnudo

La expansin CTG en la DM1

.... CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG ....

(CTG)20 El nmero de repeticiones en la poblacin general, varia entre 5 y 37 copias

La expansin CTG en la DM1

... CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG ...

(CTG)200 Las grandes repeticiones van asociadas a una aparicin precoz y una sintomatologia ms severa

La expansin CTG en la DM1

.... CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG ....

(CTG)1000 Individuos con la forma congnita suelen tener ms de 1000 repeticiones