Tecnologia do DNA Recombinante

Novas combinações de DNA criadas in vitro entre sequências de

DNA humano (ou outro) de interesse e moléculas vetores
bacterianos (ou outro) capazes de duplicação indefinida dentro de
uma linhagem de laboratório de microorganismos
Clonagem
Engenharia Genética
Biotecnologia
Aplicações forenses
Antes da Tecnologia do DNA recombinante

• Obstáculos enfrentados pelos geneticistas moleculares para

desenvolver suas investigações sobre a base molecular das
doenças hereditárias

– Obtenção de quantidade suficiente de uma seqüência de DNA ou

RNA de interesse que permita sua análise

– Purificação da seqüência de interesse dentre todos os outros

segmentos de DNA ou moléculas de mRNA presentes na célula
 Prêmio Nobel de Química 1980
• "for his fundamental
studies of the
biochemistry of Paul Berg
nucleic acids, with (1/2)
particular regard to
recombinant-DNA“

• "for their contributions

concerning the
determination of base
sequences in nucleic
acids"

Frederick Sanger Walter Gilbert

 Tudo começou com rãs e bactérias...
• 1969 – Primeiro gene isolado ( bactéria)- Metabolismo do açucar
- Hamilton Smith descobre a primeira enzima de restrição (Haemophilus
influenzae).
• 1972- Paul Berg et al. : Combina DNA de especies diferentes e re-introdus numa
célula hospede.-Nasce o DNA recombinante!
• 1973- Stanley Cohen e Herbert Boyer "cut and paste" o DNA de rãs na
bactéria E.coli. Começo da Engenharia genetica.
• 1974-1975 – 2 métodos de seqüenciamento de DNA
1. Maxam-Gilbert
2. Sequenciamento de Sanger
• 1975-Conferência Pacific Grove, California: Regularisa o uso da tecnologia do
DNA recombinante
- Robert Holley:Bateriófago MS2 sequenciado1976
- Genentech: primeira companhia de Engenharia genetica (Herbert Boyer
and Robert Swanson).
• 1978 – O gene da insulina humana é clonado.
 Engenharia Genética

Utilização de um conjunto de técnicas que permitem:

identificar, isolar e multiplicar genes

Clonagem gênica
 Etapas da Clonagem Molecular

Envolve a transferência de uma seqüência de

DNA de interesse para uma única célula
de um microorganismo

• Isolamento do DNA de interesse

• Inserção em vetores de clonagem
• Introdução do DNA recombinante em uma
célula hospedeira (transformação)
 Isolamento do DNA de interesse

• Enzimas de Restrição = “tesouras moleculares”

– Enzimas que reconhecem seqüências bifilamentares específicas
no DNA e clivam o DNA no sítio de reconhecimento ou próximo
a ele
– Clivagem: gera dois fragmentos, com pontas unifilamentares
(pontas “adesivas” – úteis para as reações subseqüentes de união
na construção de moléculas recombinantes de DNA)
– Seqüências de DNA palindrômicas (Sequência de bases no sítio
de reconhecimento, lida de 5´para 3´, é a mesma em ambos os
filamentos
– Extremidades Coesivas ou Abruptas
 Exemplos de Enzimas de Restrição

Escherichia coli Eco RI 5´ G↓AATT C 3´

3´ C TTAA↑G 5´
Haemophilus influenzae Hind III 5´ A↓ AGCT T 3´
3´ T TCGA↑A 5´
Haemophilus aegyptius Hae III 5´ GG↓CC 3´
3´ CC↑GG 5´

Enzima Acessória: DNA ligase

 Inserção em vetores de clonagem

• Vetor
– molécula de DNA que pode se replicar de modo
autonômo em um hospedeiro (bactéria ou células de
levedura) do qual pode ser isolado em forma pura para
análise
– Transportam o DNA clonado para uma célula
hospedeira, possibilitando a multiplicação do Gene de
Interesse
• Plasmídeos
• Bacteriófago Lambda
• Cosmídeos e cromossomos artificiais de bactérias
• Cromossomos artificiais de levedura
 Plasmídeos

• Molécula de DNA bifilamentar circular

• Bactérias e leveduras Eco RI
• Uma Origem de Replicação Bam HI

• Múltiplos Sítios de Clonagem Pst I resistência a Sal I

ampicilina
• Marca de Seleção resistência a
tetraciclina

(Resistência a Antibióticos)
(Seleção Enzimática - Cor)
ORI

Pvu II pBR322
 Outros vetores

• Bacteriófago Lambda
– Vírus bacteriano
– Infecção/replicação/lise da bactéria/1 milhão de bacteriófagos
– 1/3 do genoma não é essencial – trechos de DNA de até 20 Kb
• Cosmídeos e Cromossomos Artificiais de
Bactérias (BACs)
– Plasmídeos que usam a habilidade das partículas infecciosas do
bacteriófago lambda para “embalar” grandes pedaços lineares de
DNA em capas de ptns que se ligam à superfície das bactérias e
injetam seus conteúdos de DNA (50 Kb)
– BACs (100-300 Kb)
• Cromossomos Artificiais de Levedura (YAC)
– 1.000 – 2000 Kb
 sítios de
restrição

clivagem clivagem
com Eco RI com Pvu II

extremidade extremidade
protundente abrupta

DNA ligase

vetor de
clonagem

vetor
recombinante
 O Processo de Clonagem

= Introdução do DNA recombinante em uma célula hospedeira

(transformação)
→ Clone: Conjunto de células originadas pela divisão de uma
célula original (todas com o mesmo material genético)
3. Vetor e DNA de interesse são cortados com a mesma
enzima de restrição e em seguida ligados pela DNA ligase.
4. Transformação ou Infecção de Célula Competente
5. Seleção dos Transformantes
 Transformação
• O processo de transformação constitui um evento de alta
importância na técnica de manipulação gênica.

• A transformação natural descrita por Griffith, em 1928, e por

Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro.

• Em 1970, Mandel e Higa : E.coli torna-se marcadamente

competente para transformação com DNA exógeno, quando a
bactéria for suspensa em cloreto de cálcio gelado e submetida a
um curto choque térmico à 42oC.

• O procedimento do cloreto de cálcio que é usado até hoje produz

uma eficiência de transformação de 105 a 107 transformantes por
micrograma de DNA
 Transformação
• O tamanho e a conformação da molécula do DNA,
afeta o processo de transformação.
– Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados
pela célula bacteriana competente.
– DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato
de sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no
espaço periplasmático.
• Seleção de bactérias transformadas é feita através
do uso de antibióticos (plasmideos contém genes
de resistência a antibióticos)
 pBR322

digestão com Pst I Ágar

contendo
tetracilina

DNA de
interesse
DNA ligase

Transformação de
E. coli

Ágar contendo Ágar contendo

tetracilina tetracilina e ampicilina
Seleção de transformantes
Resumindo:
Finalidade da Clonagem Molecular

• Isolar um determinado gene ou outra

sequência de DNA em grandes quantidades
para posterior estudo
• Para gerar grandes quantidades de uma
sequência:
– Construção de um conjunto de clones de
bactérias ou leveduras que contenham um vetor
no qual os fragmentos de DNA foram inseridos
= Biblioteca
 Fontes dos Genes de Interesse
• PCR (quando se sabe a seqüência gênica)

• DNA genômico - Biblioteca Genômica

• RNA mensageiro - Biblioteca de cDNA -

DNAs codificantes de proteínas
Extração de RNA
Purificação de mRNA (Oligo dT)
Síntese de cDNA (transcriptase reversa) Clonagem
1. PCR: Polymerase Chain Reaction

• O processo de PCR foi inventado por Kary

Mullis no início da década de 1980, tendo-
lhe sido posteriormente atribuído o Prémio
Nobel da Química pelo seu trabalho
• É um método de amplificação (de criação
de múltiplas cópias) de DNA sem o uso de
um organismo vivo, por exemplo,
Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.
 PCR: Polymerase Chain Reaction
• 1. Desnaturação (94-96ºC, 30-600 segundos).
• Durante a desnaturação, a cadeia dupla do DNA é separada em duas cadeias simples.A
DNA polimerase é estável a altas temperaturas pois é obtida de organismos que vivem em
ambientes extremos (extremófilos). A DNA polimerase mais usada é a Taq polimerase
(obtida de Thermus aquaticus).

• 2. Annealing (emparelhamento) (45-80º C, 30-120 segundos).

• Durante o emparelhamento, os iniciadores (primers) ligam-se ao DNA de cadeia simples e
a DNA polimerase liga-se aos iniciadores emparelhados.

3. Alongamento (65-80º C, 30-120 segundos).

• Durante o alongamento, a DNA polimerase cria a cadeia de DNA complementar à medida
que percorre o DNA de cadeia simples, incorporando desoxirribonucleótidos presentes na
reação.

• Após cada ciclo, a quantidade de DNA duplica. Assim, após múltiplas ciclos, o aumento
da quantidade de DNA é exponencial de base 2. Por exemplo, após 30 ciclos, uma cadeia
de DNA é copiada em 230 = 1 073 741 824 cadeias, que são cópias exatas da parte da
primeira cadeia selecionada pelos iniciadores.
 PCR: Polymerase Chain Reaction
1. Desnaturação
(94-96ºC, 30-600
segundos).
2. Annealing
(emparelhamento) (45-
80º C, 30-120
segundos).
3. Alongamento
(65-80º C, 30-120
segundos).
PCR: Polymerase Chain Reaction
• A máquina de
PCR
(termociclador)
é basicamente
um forno onde
um programa
controla o
tempo e a
temperatura.
2. DNA genômico - Biblioteca Genômica
Cromossomo
interfásico

vetor de
clonagem

clivagem com clivagem com

enzima de enzima de restrição
restrição

DNA ligase

vetor recombinante
 RNA mensageiro - Biblioteca de cDNA

1. DNAs codificantes de proteínas

2. Extração de RNA
3. Purificação de mRNA (Oligo dT)
4. Síntese de cDNA (transcriptase reversa)
5. Clonagem
→ Apenas as seqüências
codificantes estarão presentes
neste conjunto de clones!!!!!!
Identificação do clone portador da seqüência de interesse

• Hibridização de ácidos nucléicos

– Ácidos nucléicos unifilamentares são misturados sob
condições de temperatura e concentração de sal que
permitem apenas o pareamento correto de bases entre
os filamentos de DNA
– Sondas de ácidos nucléicos
• DNA clonado ou PCR: várias centenas a vários milhares de
nucleotídeos
• Oligonucleotídos: 15-60 nucleotídeos
• Fragmento de DNA ou RNA de sequência conhecida, marcada
– radioativo,
– composto bioquímico
– substância fluorescente
 Métodos de Análise dos Ácidos Nucléicos

• Transferência Southern
– DNA/digestão/eletroforese/filtro de
nitrocelulose/hibridização com a sonda
• Análise com sondas oligonucleotídicas
específicas
• Transferência Northern
– RNA
Identificação do clone portador da seqüência de
interesse
 Hibridização in situ em cromossomos

• Hibridização das sondas ao DNA contido

dentro dos cromossomos imobilizados em
lâminas de microscopia
• Método mais comum: FISH
– Citogenética clínica diagnóstica
 Análise da Sequência de DNA

• Seqüênciamento
– Síntese de DNA
– Nucleotídos marcados radioativamente
– Eletroforese
– Seqüênciamento automatizado – Projeto
Genoma Humano
 SEQÜENCIAMENTO DE DNA
• Desenvolvido por Sanger e colaboradores (1979),
conhecido também como método do término do
crescimento da cadeia.
• Exige a clonagem do fragmento de DNA a ser sequenciado
em vetores apropriados (Ex: da série M13mp)
• O príncipio do método:
– baseia-se na capacidade da DNA polimerase copiar
uma fita de DNA a partir do molde na presença de um
iniciador.
– A reação de sequenciamento consiste na hibridização
de um oligonucleotídeo sintético (iniciador), com uma
região conhecida do vetor (M13), imediatamente
adjacente ao inserto a ser sequenciado.
 SEQÜENCIAMENTO DE DNA

4. A seguir, promove-se a síntese da fita complementar

empregando o fragmento Klenow da DNA polimerase I e
uma mistura de deoxinucleotídeos (dNTP), sendo um deles
marcado com 32P ou 35S.
5. No processo são realizadas quatro reações independentes,
sendo que em cada uma delas é adicionado um tipo de
dideoxinucleotídeo (ddNTP).
– Em cada reação, um número muito grande de moléculas de fita
complementar estão sendo copiadas simultaneamente. No entanto, em um
dado momento da extensão, uma pequena porcentagem de moléculas irá
incorporar um ddNTP e neste caso a reação de alongamento da cadeia
será automaticamente interrompida naquele sítio, devido à ausência do
grupamento 3'OH do ddNTP. Por outro lado, em outras moléculas a
reação de extensão continua a ocorrer até que um ddNTP seja
incorporado.
 SEQÜENCIAMENTO DE DNA

6. Uma vez terminadas as reações de extensão, cada

fragmento recém sintetizado é separado em gel
desnaturante de poliacrilamida-uréia e a seguir
autoradiografado. Como este tipo de gel tem alto poder de
resolução, é possível então visualizar na autoradiografia
cada um dos fragmentos sintetizados como uma banda
específica. Desta forma, é possível analizar de 200 a 300
nucleotídeos por gel.

7. Sendo assim, em cada uma das quatro reações, haverá

fragmentos de todos os tamanhos sendo que todos eles tem
início comum ou seja adjacente ao iniciador.
Exemplos da utilização da engenharia genética
podem ser dados na produção de :

– Melhora da qualidade das vacinas contra as doenças

(vacinas de DNA);
– Produtos humanos puros e em quantidades comerciais
como a insulina e o hormônio de crescimento;
– Produção de antibióticos por meios mais econômicos
ou outrora não existentes;
– Plantas mais resitentes a pesticidas, doenças e a insetos;
– Plantas com melhora em sua qualidade nutricional.
 A tecnologia do DNA recombinante também é
usada em:

• Terapia gênica
• Diagnósticos de doenças genéticas
• Medicina forense
– Identificação de indivíduos (RFLP - Restriction
Fragment Length Polymorfism )
– Teste de paternidade (STR- Short Tandem
Repeats)