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Antonio Barbadilla

Tema 10: Clonacin y secuenciacin del DNA

Clonacin y secuenciacin del DNA 1

Objetivos tema 10: Clonacin y secuenciacin del DNA

Debern quedar bien claros los siguientes puntos: Cmo se manipula el DNA? Las endonucleasas (enzimas) de restriccin Clonacin del DNA: DNA forneo, vector de clonacin, organismo husped, seleccin de vectores Vectores eucariticos Organismos transgnicos Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto Mapas de restriccin Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La secuenciacin del DNA
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Clonacin y secuenciacin del DNA

Manipulacin del DNA

Estudio de una secuencia especfica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogneo de secuencias. Aislamiento, amplificacin, secuenciacin y expresin de un fragmento de DNA especfico Esta tecnologa se denomina: Tecnologa del DNA recombinante, clonacin gnica o ingeniera gentica
Ningn campo de la biologa ha permanecido igual tras esta revolucin tecnolgica

Propiedad bsica del DNA que permite su manipulacin:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificacin, aislamiento, clonacin,... De fragmentos de Dr. Antonio Barbadilla DNA complementarios a uno dado
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Herramienta bsica
Endonucleasas (enzimas) de restriccin -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA especficas y lo cortan por el esqueleto azcar-fosfato. Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar) Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palndromes 5-GGATCC- 3 3-CCTAGG- 5

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EcoRI: E. Coli BamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes: Corte plano: extremos romos Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos
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Herramienta bsica

Las enzimas de restriccin tipo II: Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias especficas, produciendo por tanto una poblacin Dr. Antonio Barbadilla heterognea de fragmentos de extremos idnticos
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Clonacin del DNA

DNA forneo (secuencia que se desea clonar)
Vector de clonacin (vehculo) Organismo husped (E. Coli)
Vector hbrido

Seleccin de vectores

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C l o n a c i n d e l

Vectores hbridos (quimera)

Fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restriccin. Ligasa sella zona hbrida

Plsmido (1 sitio D de corte) 2-15 kb

Vectores de clonacin

N Fago A (Lambda)
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Csmido

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C l o n a c i n d e l D N A

Vectores de clonacin
Fago (2 sitios de corte) < 24 kb

Fago

Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacterifago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb
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C l o n a c i n d e l D N A

Vectores de clonacin

Csmido: extremos cos + DNA plsmido (origen replicacin) + DNA forneo + cpisde. ~50 kb
BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plsmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas

Csmido

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C l o n a c i n d e l D N A

Husped: E. coli
Insercin del vector hbrido en el husped: Plsmido: transformacin (solucin diluida cloruro de calcio) y replicacin autnoma

Fago (transduccin, insercin en DNA husped)

Csmido (transduccin como fago y replicacin como plsmido)

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C l o n a c i n d e l D N A

Seleccin de vectores hbridos

Plsmido: resistencia a antibiticos

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Fago : Insercin en E. coli (slo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto forneo) Clonacin y secuenciacin del DNA

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C l o n a c i n d e l D N A

Obtencin de la secuencia que se clona

Un gen Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene intrones): uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina humana recombinante en bacterias) Sntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacdica se puede hacer DNA con la ayuda del cdigo (no regin promotora ni controladora de la expresin) ~100bp Fragmentos del genoma por digestin con enzimas de restriccin (aleotoria o perdigonada, Shotgun) Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo
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Vectores eucariticos

Permite obtener las mximas ventajas de genes eucariotas Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs): Plsmidos + Secuencia replicadora + centrmero de levadura + (telmero levadura) Puede incorporar ms de 500 kb de DNA

Resistencia a antibitico (p.e., ampr)

Origen de replicacin del DNA de levadura (ARS) Regin centromrica (CEN)

Linealizacin (con endonucleasas) y adicin de extremos telomricos

Origen de replicacin bacteriano (ori)

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Telmero

ampr

ori

CEN ARS

Telmero
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Introduccin de DNA forneo en eucariotas Organismo transgnico: un eucariota con DNA forneo
Mtodos transfeccin
Clulas eucariotas toman DNA forneo del ambiente con fosfato clcico (poco eficiente) Inyeccin en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma (ratones transgnicos 15% eficiencia)

Transfeccin:

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Mtodos transfeccin
Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA forneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infeccin viral)

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Mtodos transfeccin
Electroporacin: se usa corriente elctrica para introducir DNA Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesculas de membrana artificial) Biolstica (mitocondrias y cloroplastos): disparo de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA Plsmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y elementos mviles (Elemento P en Drosophila)

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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogneos de fragmentos

Poblacin de fragmentos

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Separacin fragmentos

Reptacin de los fragmentos a travs del gel de agarosa

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DNA teido con bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV

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Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogneos de fragmentos

Transferencia en Southern (Southern blotting) Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA

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Transferencia en Southern (esquema resumen)

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Mapas de restriccin
mediante enzimas de restriccin

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Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP)

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La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

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Clonacin y secuenciacin del DNA

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Secuenciacin
traza Fsiles

Usos de la PCR

DNA fsil (evolucin,DNA arqueologa, historia)

Mamut lanudo (40000 aos) Abraham Lincoln (sndrome de Marfan, afecta tejido conectivo, fribrilina) Hombre Neandertal > Hablaba como nosotros? Color cabello?

Huellas dactilares del DNA

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(DNA forense)

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Secuenciacin de DNA
La secuencia nucleotdica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento ms completo de la estructura y funcin de un gen. La base molecular de mutaciones especficas en un gen pueden investigarse Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes La comparacin de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolucin molecular Secuenciacin de genomas: estructura del genoma
Mtodos: Secuenciacin manual (inicial) Qumico (Maxam y Gilbert 1977) Didesoxi (Sanger 1977)
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Disoxi

Secuenciacin automatizada (1986,)

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Didesoxi29

Secuenciacin del DNA

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Secuenciacin automatizada del DNA

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Animaciones de tcnicas de la gentica

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

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