Salud y medio ambiente

rea Qumica General Pruebas a corto plazo para evaluacin de genotoxicidad. Test de Ames y de Allium Dra. Marcela Rizzotto 2011

Toxicologa
Estudio de los efectos que producen agentes Qumicos o fsicos sobre los organismos vivos

Gentica toxicolgica
Rama de la gentica y especialidad de la toxicologa, cuyo inters se centra en identificar y analizar la accin de agentes con actividad sobre el material genticos de los seres vivos. Compuestos qumicos pueden interactuar directa o indirectamente con el DNA, produciendo cambios que afectan el

nformacin gentica
duplicacin ADN proceso comn a todos los seres vivos

teraciones en la informacin gentica:

r alteraciones en la molcula de ADN

Mutaciones # vida normal y sana: evolucin

# enfermedades y/o malformaciones

congnit congni

Mutgeno Agente fsico, qumico o biolgico que altera la secuencia del ADN

Mutgenos
* Directos * Indirectos o Promutgenos Sin activacin metablica con activacin metablica agregada clulas aisladas Se observa efecto nocivo

clulas aisladas No se observa efecto nocivo

Sin activacin metablica, en sistemas de clulas aisladas no se pueden detectar promutgenos.

* Muchos mutgenos son carcingenos * Muchos carcingenos daan el ADN, siendo mutagnicos para bacterias y humanos

Cncer: Enfermedad en la cual el organismo produce un exceso de clulas malignas, con rasgos tpicos de comportamiento y de crecimiento y divisin descontrolados. El cncer causa cerca del 13% de todas las muertes.

Etapas del proceso de carcinognesis Iniciacin: la clula normal sufre directa o indirectamente una alteracin en su DNA (lesin inicial, genotoxicidad) Promocin: ocurre proliferacin a partir de la clula daada para dar lugar a un tumor benigno (sustancias promotoras) Progresin: etapa final. Algunas sustancias (carcingenos) lueden hacer que las clulas tumorales an benignas adquieran carcter maligno y se vuelvan capaces de invadir tejidos circundantes.

Relacin entre genotoxicidad e iniciacin de neoplasia

Carcingeno
Cualquier agente capaz de incrementar la incidencia de malignidad neoplsica.
(segn naturaleza)

Clasificacin

Ejemplos
nitrosaminas, aromticos rad. ionizantes (rayos

* Qumicos

hidrocarburos

* Fsicos
X), luz UV

* Biolgicos
papiloma),

virus (hepatitis,

Helicobacter pylori

CLASIFICACION DE CARCINGENOS
(segn accin sobre DNA) # GENOTXICOS: Dao directo al ADN; formacin de aductos, mutaciones y aberraciones cromosmicas. Dan positivas pruebas de mutagenicidad # EPIGENTICOS: No modifican directamente el ADN (dan negativas las pruebas de mutagenicidad). Modulacin del crecimiento y muerte celular. Los agentes epigenticos son citotxicos, produciendo un perjuicio crnico en las clulas que resulta en un aumento en la proliferacin celular. En general, los agentes epigenticos se pueden considerar como promotores en la expansin de clulas espontneamente iniciadas. Algunos de estos agentes qumicos son el benceno, cloroformo, tricloroetileno, furfural, metapirileno, lindano y bifenilos policlorinados.

Los marcadores biolgicos o biomarcadores son los cambios medibles, ya sean bioqumicos, fisiolgicos o morfolgicos que se asocian a la exposicin a un txico.

Biomarcador de exposicin: indica la presencia de una sustancia exgena o sus metabolitos en un organismo intoxicado Biomarcador de susceptibilidad: indica una limitacin adquirida de un organismo en respuesta a la exposicin a un toxico

Biomarcador de efecto: indicador de alteracin bioqumica, fisiolgica o gentica, por la exposicin a un agente txico. Segn su magnitud ser reconocido como un dao o como una enfermedad potencial.

Biomarcadores de efecto citotxico * ndice mittico: mide % de clulas en divisin * Proliferacin celular: mide alteracin de la velocidad del ciclo celular. Biomarcadores de efecto genotxico * Mutaciones gnicas * Aberraciones cromosmicas * Roturas de doble y simple cadena del DNA

Evaluacin de Genotoxicidad/Antigenotoxicidad

Estudios a Corto Plazo

Estudios a Largo Plazo en animales

Altamente predictivos de carcinogenicidad

Evaluacin de capacidad genotxica/antigenotxica

Pruebas a corto plazo

* Test de mutaciones gnicas en bacterias # Test de Ames

* Test de mutaciones cromosmicas # Aberraciones cromosmicas en vegetales Test de Allium cepa # Formacin de microncleos en vegetales Test de Allium cepa

Test de Ames
Salmonella typhimurium TA100
MUTGENO

TA98

His dependientes: sin His la cepa no crece

His independientes: sin His la cepa crece (colonias revertidas)

ENSAYO DE REVERSION CON LA CEPA TA100 DE Salmonella typhimurium

control (sin mutgeno) con azida sdica

Cepas de Salmonella typhimurium ms empleadas Cepa

Tipo de mutgenos que detecta

ejemplos de mutgenos

Mutgenos * 2-nitrofluoreno que NO2 hisD3052 producen corrimiento del marco de * nitrosoderivados de lectura aminas aromticas

TA98

TA100
hisG46

Mutgenos que producen sustitucin de pares de

carcinognicas NaN 3 , aflatoxina B1

Test de Ames
CEPA BACTERIANA ( S. typhimurium TA 98 y TA 100)

+/-S9

Diversas concentraciones de muestra (dosis crecientes)

MEDIO MINIMO INCUBACIN RESULTADOS

Control negativo

.. ..

A MAYOR DOSIS DE MUESTRA MAYOR N MUTANTES (mayor actividad mutagnica)

Expresin de resultados
* curva dosis respuesta: N revertantes/placa vs dosis * C.R.: N revertantes placa ensayada/N revertantes placa control CR 2 significa material mutagnico

p s et n at r ev e R ) sei m l (

Maron, D.M. and Ames, B. (1983). Mutation Research 113, 173-215. g mutgeno por placa

Test de Allium cepa (prueba de la cebolla) Ventajas

* Sistema eucariota, con estrecha relacin con sistemas animales y humanos. Las plantas tienen una activacin metablica, semejante a animales y una capacidad de reparar su DNA ante alteraciones genticas por mecanismos similares a los humanos. * Simplicidad en el manejo de las tcnicas, realizables en cortos perodos de tiempo * Rpidos resultados * Bajo costo * Alta sensibilidad * Las plantas pueden manifestar efectos genotxicos y daos fisiolgicos visibles causados por sobredosis. Estos parmetros secundarios pueden ser usados para determinar la dosis

Efluentes industriales Tucumn 2008, Dra. Mara Ins Isla y

col. Biotest de Allium cepa utilizando distintas muestras de efluentes: (1) Control negativo
1 2

(2) Muestras de efluentes de las diferentes industrias (3) Control positivo: K2Cr2O7 100 mg/L

Tcnica operatoria

Bulbos de cebolla amarilla, limpios, sin catfilas externas, 48 h en agua mineral 24 horas en sustancia a ensayar (2-4 ciclos de divisin celular) + control positivo (K2Cr2O7 1-100 ppm) + control negativo

Anlisis macroscpico * Fitotoxicidad: LC50: concentracin inhibitoria de longitud de races al 50%. Anomalas (necrosis, tumores, ganchos ,etc.) Anlisis microscpico (MO 640 X-1000 X, zoom cmara digital) * Genotoxicidad
# aberraciones cromosmicas # microncleos (MN): tratamiento 24 h + 24 h recuperacin

Esquema para determinar fitotoxicidad mediante el Allium test

(adaptado de: http://www.educa.ma )

A B

C D

Elongacin radicular de Allium cepa tratadas con efluentes industriales luego del perodo de recuperacin de 24 h en agua mineral (A) (B) (C) (D) (E) Efluente de una industria Efluente de una industria Efluente de una industria Efluente de una industria Control negativo. azucarera, papelera, citrcola, minera,

Allium test en Rosario

ANALISIS CITOGENETICO * 5 - 15 pices radiculares (Fijacin: etanol-cido actico (3:1, v:v) durante 18 a 24 horas. Conservacin: etanol 70 % a 4 C (mximo: 6 meses). Para observacin: * Hidrlisis: HCl 1-6 M a 60 C (5-10 min) o a 25C (20-60 min) * Tincin: Reactivo de Schiff (15 min, oscuridad). * Preparado: tcnica de aplastado (squash), en orcena actica, o carmn actico. Se analizan 10 campos por muestra, observando microscpicamente 1000 clulas/preparado (5 muestras/dosis: 5000 clulas). Se calcula el ndice mittico ( % IM ), ndice de fases mitticas y frecuencia de anomalas microscpicas (clulas binucleadas, citoplasma granuloso, microncleos, c- mitosis, puentes, cromosomas fragmentados, etc.)

Algunos materiales empleados para el Allium test

( http://www.educa.madrid.org/web/ies.laestrella.madrid/departament )

Seccin longitudinal de raz de cebolla mostrando las distintas zonas (adaptado de: http://www.uc.cl/sw_educ/biolo )

squema del ciclo celular

Ciclo celular y condensacin/descondensacin de la cromatina M: mitosis; G1: fase de crecimiento postmittica; D: diferenciacin para formar clulas hsticas, cuyo DNA permanece sin replicarse; G0, R: reembrionalizacin (por ej., en la regeneracin); S: replicacin del DNA; fase premittica

B-C-D. Profase. Comienza la mitosis. Los cromosomas son claramente distinguibles bajo el microscopio ptico. Son de naturaleza doble. Se comienzan a formar los microtbulos del huso mittico. La membrana nuclear se colapsa totalmente. El nucleolo desaparece.

E. Metafase temprana. El centrmero de cada cromosoma se adhiere a los microtbulos del huso en formacin. Cada cromosoma es conducido hacia el ecuador celular por los microtbulos.

F. Metafase Tarda. Se han completado en este momento las fibras del aparato del huso. Los microtbulos mas cortos se adhieren en el centrmero para conectar cada cromtida con un polo. Otros microtbulos corren de un polo al otro.

G. Anafase. Cada centrmero se divide, lo cual permite la separacin de las cromtidas hermanas. Los microtbulos del aparato del huso guan a las dos cromtidas de cada cromosoma hacia los polos.

H. Telofase Temprana. Se comienzan a condensar vesculas en la nueva placa celular. Comienzan a formarse tambin las nuevas membranas celulares cuando los cromosomas llegan a los polos.

I. Telofase tarda. La nueva membrana nuclear ya est completa y la cromatina de los cromosomas se despliega. Tambin se termina la nueva pared celular entre las dos clulas recin formadas.

pices radiculares coloreados con el reactivo de Schiff y observados en un microscopio ptico Olympus CH, con objetivo y ocular de 10X

(Nieva Moreno et al., 2005)

anafase y telofase normal

metafase; telofase precoz (1000 X)

anafase multipolar Dra. Mara Ins Isla, Instituto de Estudios Vegetales Dr Antonio Rodolfo Sampietro Facultad de C-mitosis
Bioqumica, Qumica y Farmacia, UNT, Ayacucho 461, 4000 San Miguel de Tucumn, Argentina

A: anafase normal B: anafase con fragmento

C: telofase con 2 puentes y fragmento

Lectura: AC en 800 clulas en anafase (N y T) y telofase (T). MN: en 5000 clulas en interfase. Estadstica: ANOVA

Clula HepG2 con microncleo, observada al microscpio ptico.

Lectura: MN en 1000 clulas. Estadstica: ANOVA

ervadas en clulas meristemticas de Allium cepa expuestas a agentes qumicos

lium test. Aberraciones cromosmicas en metafas metafa

(A) Nomal metaphase; (A1) Metaphase with chromosome break; (A2) C-metaphases; (A3) Metaphase with chromosome loss; (A4) Binucleated cell in metaphase; (A5)Metaphase with chromosome adherence

llium test. Aberraciones cromosmicas en anafas

servadas en clulas meristemticas de Allium cepa expuestas a agentes qumicos

(B) Normal anaphase; (B1) Anaphase with chromosome bridge; (B2) Anaphase with chromosome breaks; (B3) Anaphase with bridge and chromosome loss; (B4) Anaphase with chromosome loss; (B5) Multipolar anaphase

ervadas en clulas meristemticas de Allium cepa expuestas a agentes qumicos

lium test. Aberraciones cromosmicas en telofas

(C) Normal telophase; (C1) Telophase with chromosome bridge; (C2) Telophase with bridge and chromosome loss; (C3) Telophase with chromosome break; (C4) Multipolar telophase; (C5) Multipolar telophase with chromosome bridge

Allium cepa meristematic cells carrying MN (A) Normal interphase;

(A1) micronucleated cell in interphase; (B) Normal prophase; (B1) MN in prophase.

Allium cepa test in environmental monitoring: A review on its application. Daniela Morais Leme, Maria Aparecida Marin-Morales, Dto de Biologia, Instituto de Biociencias, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Rio Claro, SP, Brazil; Mutation Research 682 (2009) 7181

Allium cepa meristematic cells carrying MN. (C) Normal metaphase; (C1) MN in metaphase; (D) Normal anaphase; (D1) Anaphase with MN; (E) Normal telophase; (E1) Telophase with MN and chromosome loss.

Control positivo: K 2 Cr 2 O 7 1 ppm, AC: cromosoma puente en anafase

Profase y anafase normal (agua mineral)

Mitosis en clulas meristemticas de cebolla amarilla, 400 X + zoom cmara digital, microscopio ptico (tesina de Cecilia Giulidori)
H2PST

Co(II)-FST

Nitratos, nitritos y compuestos N -nitroso

vegetales industria fertilizantes nitrato nitrito

botulismo metahemoglobinemia en nios < 3 meses edad

nitrito

aminas, amidas

N -nitrosoderivados
potenciales carcingenos

Nitrosacin por interaccin de drogas con nitrito

De 182 drogas analizadas, 173 (95%) formaron compuestos N-nitroso (mutagnicos y/o cancergenos)

La nitrosacin endgena de drogas es, an hoy, un tema ampliamente ignorado

G. Brambilla et al, Mutation Research 635 (2007) 17-52

aminas/amid as + nitrito en medio cido

NITROSACI N

nitrosamina s/nitrosamid as

Alquilacin de guanina

Nitrosaminas y nitrosamidas son alquilan -tes

Vas de ingestin de nitratos y nitritos y sus posibles efectos txicos

Tendencia de las hortalizas y verduras a acumular nitratos Elevada Espinaca Bruselas Acelga Endivia Repollo blanco tiernas Lechuga Cebolla Hinojo verdes Remolacha Pepino Media Col roja Coliflor Apio Col y nabo Calabacn Berenjena Judas Cebollas Baja Coles de

itratos en hortalizas y verduras

ctores que aumentan su contenido:

Prcticas agrcolas inadecuadas (mezcla desecho e animales, residuos industriales, basura, etc.)

Abuso de fertilizantes nitrogenados

Cultivo en invernadero (falta de luz solar etabolizacin incorrecta del abono)

Horario de cosecha (menor contenido en las sechadas por la tarde, luego de un da de sol)

Tipo de hortaliza: por ej., frutas, tomate: acumulan poco poc

Vas de formacin in vivo de las Nnitrosaminas

Carcingensis inducida por las N-nitrosaminas

COOH CO HN

ftalilsulfatiazol (H2FST)
S SO2NH N

amida 2ria.
H2N

sulfatiazol (HST)
S SO2NH N

amina 1ria.

amida 1ria.

H2N

SO 3H

H2N

SO 2NH2

cido sulfanlico (ASA)

sulfanilamida (SA)

Algunas evidencias de nitrosacin de sulfas

*La reaccin entre sulfanilamida y nitrito en jugo gstrico gener un compuesto genotoxico (1,3-di(4sulfamoilfenil)triaceno ):

*Se encontraron compuestos genotxicos como productos de nitrosacin de

Mezclas sulfa-nitrito-HCl 1M (sulfatiazol sdico, ftalilsulfatiazol, complejo Co(II)-ST)

Comportamiento mutagnico (test de Ames) Tesis Dra. Claudia Trossero (2005)

Antimutgenos
Tesis Lic. Ana Pontoriero, en curso

cido L-ascrbico T verde

Inhibidores de las reacciones de nitrosacin

Epigalocatequina galato, principal polifenol del t verde

Mecanismos de accin de agentes quimiopreventivos

Mutagenicidad del sistema NaST + NaNO 2 + HCl 1 M

3,0

TA98 TA100

reversion coefficient

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

10

15

20

25

30

initial g NaST/plate
(C. Trossero; A. Pontoriero, E. Hure, L. Monti, C. Gorr, N. Mosconi, M. Rizzotto*, G. Caffarena, Reaction mixtures formed by nitrite and selected sulfa-drugs showed mutagenicity in acidic medium Qum. Nova 32, 5 (2009) 1151-1156)

Inhibicin de la mutagenicidad del sistema NaST + NaNO 2 + HCl 1 M por cido Lascrbico en el test de Ames
4,0 3,5 reversion coefficient 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0 500 1000 1500 2000

L-ascorbic acid, nmol/plate

(Pontoriero AC, Rizzotto M* 2010 Inhibition of the mutagenic effects of sulfatiazole-nitrite mixture by L-ascorbic acid and green tea AAPS Pharm Sci Tech, Ed. Springer, en prensa)

Inhibicin de la mutagenicidad del sistema NaST + NaNO 2 + HCl 1 M por cido Lascrbico en el test de Ames
100 80 60 % inh. 40 20 0 0 1000 2000 3000 4000
baja conc. conc. media conc. alta

L-ascorbic acid, nmol/plate

% inh. = [(CRsinAM - CRconAM)/ (CRsinAM - 1)]100

Inhibicin de la mutagenicidad del sistema NaST + NaNO 2 + HCl 1 M por extractos de t verde en el test de Ames

100 % mutagenicity inhibition 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80

strong green tea (aqueous extract) L/plate

Inhibicin de la mutagenicidad del sistema NaST + NaNO 2 + HCl 1 M por extractos de t verde en el test de Ames
100 % mutagenicity inhibition 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80

green tea aqueous extract (dilution 1/10), L/plate

Mutagenicidad del complejo Co(III)-ST en el test de Ames

180 160 140 revertants/plate 120 100 80 60 40 20 0 0 100 200 300 400 Co(III)-ST, nmol/plate 500 600
TA98 TA100

Mutagenicidad del sistema Co(III)-ST + NaNO 2 + HCl 1M en el test de Ames

TA98 TA100

6 Coeficiente de reversin 5 4 3 2 1 0

200 400 600 800 1000 1200 [ST-Co(III)]0, nmol/placa

Inhibicin de la mutagenicidad del sistema Co(III)-ST + NaNO2 + HCl 1M por cido L-ascrbico en el test de Ames

120 % inhibicin mutagenicidad 100 80 60 40 20 0 0 500 1000 1500

TA98 TA100

2000

cido L-ascrbico, nmol/placa

Glibenclamida (antidiabtico) Mutagenicidad del sistema glibenclamida + NaNO 2 + HCl 1M en el test de Ames
250 200 150 100 50 0 -20
0,0 0 500 1000 1500 2000 C.R. 2,0
TA98 TA100

N revertantes/placa

1,5 1,0 0,5

20

40

60

80

100 120 140

[glibenclamida] 0, nmol/placa

[glibenclamida]0, nmol/placa

Aberraciones cromosmicas detectadas en las mezclas de nitrito en medio cido con Co(III)-ST (a) y con glibenclamida (b)

(a) Co(III)-ST + nitrito

(b) glibenclamida + nitrito

Muchas gracias