Tecnologia Recombinante

Tecnologia Recombinante
Conjunto de tcnicas para manipulao de cidos nucleicos; Clonagem de fragmentos de DNA em plasmdios de bactrias; Seqnciamento de DNA; Amplificao de uma seq. Especifica de DNA pela tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR); Construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs; Vetores de expresso (procariotos e eucariotos); Plantas transgnicas; Animais transgnicos;

Tecnologia Recombinante
Possibilitam introduzir e tornar funcional, num ser vivo, um gene proveniente de outro de espcie diferente, o que permite criar microrganismos capazes de sintetizarem protenas com interesse comercial e alterar caractersticas de plantas e de animais. Os eventuais impactos negativos sobre o ambiente, a sade pblica e a sociedade e seus potenciais valores positivos so controvertidos.

Tecnologia do DNA- Recombinante

DNA recombinate
Molcula hbrida obtida pela unio de DNAs de fontes biologicamente diferentes. Esses segmentos de DNAs de organismos diferentes so cortados pela mesma enzima de restrio e unida pela enzima DNA ligase, produzindo dessa forma uma molcula hbrida.

Constitui no isolamento dos genes de interesse de tcnicas de clonagem.

Tcnicas utilizadas para o melhoramento gentico de bactrias Recombinao unio de genes.

Mecanismos de replicao e expresso gnica, Determinao da seqncia de um gene e conseqentemente da protena codificada, Desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina humana, hormnio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades.

Tecnologia do DNA-Recombinante
Procedimento

PRINCPIOS DE CLONAGEM MOLECULAR

-Endonucleases de restrio
-Enzimas de modificao

Enzimas de restrio
As enzimas de restrio, tambm chamadas de endonucleases de restrio, reconhecem uma seqncia de bases especfica na duplahlice de DNA e cortam ambas as fitas da hlice, em lugares determinados.

Tipos de endonucleases
Tipo I: digerem o DNA aleatoriamente. Tipo II: reconhecem seqncias especficas de nucleotdeos e digerem a molcula de DNA nestas regies ou em regies muito prximas Tipo III: reconhecem seqncias especficas de nucleotdeos na dupla-fita de DNA e o digerem em dentro destas seqncias ou em regies prximas.

Endonucleases Tipo II
-Reconhecem stios especficos na molcula de DNA -stios palindrmicos: 5---acgtgagAAGCTTagccgta---3 3---tgcactaTTCGAAtcggcat---5 e hidrolisam as ligaes fosfodister entre nucleotdeos.

-cada enzima reconhece um stio especfico.

Clonagem Molecular
Conjunto de tcnicas que permitem que determinada seqncia de DNA seja inserida em vetores e mantida em hospedeiros.

Os hospedeiros mais comuns so bactrias, mas clulas eucariticas tambm podem albergar vetores.

Definies
Clone: linhagem celular derivada de uma nica clula;
Clone de um gene: molcula especfica de DNA que pode ser purificada porque est carreada por um clone de clulas; Vetor: o veculo que transporta a molcula de DNA para dentro da clula hospedeira.

PRINCPIOS DE CLONAGEM DE MOLECULAR

1. Construo de molculas de DNA recombinante;

2. Transformao;
3. Propagao seletiva de clones;

4. Isolamento de clones de DNA recombinante;

5. Construo de bibliotecas genmicas e de expresso.

Vetores de Restrio
Veculo que transporta o gene para o interior da clula hospedeira. Dentro da clula hospedeira o vetor multiplica-se. Aps um grande nmero de divises celulares, produzido uma colnia ou clone, de clulas hospedeiras idnticas. Cada clula no clone contm uma ou mais cpias da molcula de DNA recombinante. O gene transportado pela molcula recombinante agora conhecido como sendo clone

VETORES DE EXPRESSO
Utilizados para permitir a expresso de genes alvo em hospedeiros heterlogos:
Expresso de protenas em E. coli; Expresso de protenas em outros tipos de clulas (fungos, insetos, mamferos);

Motivos:
Produzir grandes quantidades de uma determinada protenas para anlise estrutural Anlise funcional desta protena.

Clonagem Molecular
Vetores: -molculas de DNA com replicao autnoma em hospedeiros como bactria ou levedura.
Insertos: -fragmentos de DNA que so ligados aos vetores Clone recombinante: -molcula formada pela ligao do inserto ao vetor

Vetores
Molculas de DNA com replicao autnoma em hospedeiros como bactria ou levedura.
Plasmdeos pequena molcula circular. Fagos vetores derivados de genomas virais. A poro central do genoma removida e substituda pela seqncia de DNA que se deseja clonar. Cosmdeos formado pela adio de DNA de fago a um plasmdeo.

YACs (cromossomos artificiais de levedura) molculas lineares utilizadas em eucariotos.

Elementos extracromossmicos
-Molculas de DNA adicionais aos cromossomos principais; -Plasmdeos: -molculas extracromossmicas encontradas em bactrias; -so circulares; -apresentam replicao autnoma; -codificam genes de resistncia a antibiticos ou tratos de virulncia; -podem ser manipulados de forma a carregarem DNA heterlogo.

Vetores para clonagem de DNA

Plasmdeos
Caractersticas:
- Origem de replicao: seqncias nicas de DNA presentes no genoma de um organismo nas quais a replicao do DNA inicia. - Marcador para seleo: gene que confere resistncia a antibiticos como ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina. - MSC (stio mltiplo de clonagem): facilita a insero do gene de interesse na orientao correta.

Plasmdeos
Vantagens: Pequenos fcil manipulao; Estratgias de seleo diretas; teis para clonagem de pequenos fragmentos de DNA (< 10kb);

Desvantagens:
Menor utilidade na clonagem de grandes fragmentos de DNA

Vetores para clonagem de DNA

Plasmdeos

pBR322
Marcadores de seleo: Ampicilina Tetraciclina
Stios de corte nico: EcoRI BamHI

Vetores para clonagem de DNA

Stios Mltiplos de Clonagem (MCS)

Vetores para clonagem de DNA

Stios Mltiplos de Clonagem (MCS)

pUC18/19
Marcador de seleo: Apicilina
Vrios stios de corte nico

-Complementao utilizando o gene de lac-Z (seleo de clones recombinantes pela cor azul)

Vetores Lambda ():

So vetores derivados dos bacterifagos () vrus de E. coli extensivamente estudados;

Vantagens:
teis para clonagem de insertos maiores (1023kb); Seleo inerente de tamanho de insertos;

Desvantagens:
Manipulao mais difcil.

Fagos (ciclo ltico)

A liberao dos novos fagos est associada lise da clula bacteriana. A replicao do DNA do fago seguida imediatamente pela sntese de protenas do cpside, e a molcula de DNA do fago nunca se mantm numa condio estvel na clula hospedeira.

Fagos (ciclo lisognico)

Reteno da molcula de DNA do fago na bactria hospedeira, durante milhares de divises celulares. Com a presena de muitos fagos lisognicos o DNA do fago inserido no genoma da bactria de uma forma similar insero epissmica. A forma integrada do DNA do fago (chamado o profago) quiescente e a bactria que transporta o profago no se consegue normalmente distinguir, em termos fisiolgicos de uma clula no infectada. Contudo, o profago eventualmente libertado do genoma hospedeiro e o fago volta ao modo ltico e provoca a lise da clula.

Cosmdeos:
Combina as propriedades dos plasmdeos e dos stios de clonagem de vetores (cos); Vantagens:
teis para clonagem de fragmentos muito longos de DNA (32-47kb); Seleo inerente de grandes fragmentos de DNA; To fcil manipulao como plasmdeos

Desvantagens:
Difcil clonagem de fragmentos acima de 50kb

BACs e YACs
BACs:
Cromossomo Artificial de Bactrias

YACs:
Cromossomo Artificial de Leveduras

Vantagens:
teis para clonar fragmentos de DNA extremamente grandes 100-2.000kb; Ferramenta muito importante em projetos genoma;

Desvantagens:
Difcil manipulao

Clonagem de DNA Transformao Bacteriana

Seleo de clones recombinantes

Vetores para clonagem de DNA

Cromossomos artificiais de bactrias BACs

Vetores para clonagem de DNA

Fagos
Caractersticas: -correspondem a genomas de vrus que infectam bactrias bacterifagos;

-um dos fagos mais utilizados o fago Lambda.

Molcula Hibrida - Bactria

E.Coli clula
competente Tratamento c/ Nacl , choque trmico, este tratamento permite a insero do plasmidio

Melhoramento Clssico X

Tecnologia do DNA Recombinante

Melhoramento Clssico
A transferncia de genes se dava por meio de cruzamento, misturando todo o conjunto de genes em combinao aleatria.

Tecnologia do DNA Recombinante

Foi desenvolvida em 1973 e permite a transferncia de material gentico de um organismo para outro de forma efetiva e eficiente.

Tcnicas biotecnologicas:
transgnicos produo e pesquisa de plantas e animais

clonagem de mamferos.
produo de protenas humanas em microorganismos, plantas e animais.

mapeamento de genomas. tcnicas de deteco e diagnstico por PCR. terapia gnica

ASPECTOS IMPORTANTES
Hoje:
Transgenes que codificam caractersticas que
visam minimizar stress ambientais (resistncia a herbicidas, insetos e virus).

Futuro:
Transgenes que codifiquem caractersticas que visem aumentar a qualidade nutricional dos alimentos.

Alguns produtos recombinantes comercializados

- Anticoagulantes - Insulina humana

- Fatores de coagulao
- Eritropoetina - Fatores de crescimento - Hormnio do crescimento

- Interferons
- Interleucinas - Anticorpos monoclonais - Antgenos recombinantes