Universidade do Estado do Rio de Janeiro Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes Disciplina Tcnicas Bsicas em Imunohistoqumica

Fixao
Gabriela Skinner Leonardo Mendona

Tiago Savignon

Definio

s. f., ato de fixar;

operao qumica pela qual se torna fixo um corpo voltil;

Citol., operao que permite realar os elementos das clulas, a fim de as estudar;
Citol., Histol., operao fundamental da tcnica citolgica e histolgica, que tem como objetivo suspender rapidamente a atividade de todas as enzimas presentes na matria viva, de forma a impedir as alteraes prprias de cadaverizao e a conservar as estruturas, tanto quanto possvel, iguais s que existiam em vida;

Os principais objetivos da fixao

Evitar a autlise, que a destruio da clula pelas suas prprias enzimas - Atravs da inativao de enzimas proteolticas; Evitar ao mximo possvel alteraes das estruturas citolgicas e histolgicas das clulas e tecidos; Proteger, atravs do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos tcnicos posteriores; Impedir atividade e proliferao de bactrias; Melhorar a diferenciao tica dos tecidos; Facilitar a colorao (corantes comuns no penetram em clulas vivas necessidade de fixar clula - no depende apenas da afinidade dos corantes pelo tecido); Permitir o estudo da clula ou tecido como se estivesse vivo.

FIXAO

FSICA (calor e frio) QUMICA

FRIO Temperaturas baixssimas

CALOR

Alterao profunda dos tecidos

Utilizado para fixao de bactrias e leveduras Eventualmente em fixao de esfregaos

Impedir progresso da autlise

Endurecimento de tecidos para execuo de cortes histolgicos

SUBSTNCIAS QUMICAS

Processo mais utilizado para a fixao dos tecidos;

So empregadas sob a forma de lquidos fixadores; Ao direta sobre as protenas Como as protenas so as principais molculas estruturais das clulas, os fixadores devem atuar sobre elas, tornando-as insolveis;

Efeitos da fixao no reconhecimento do antgeno pelos anticorpos

Modificar cadeias laterais de aminocidos que se fizerem parte do epitopo, os anticorpos no vo interagir Frequentemente desnatura o antgeno e causa a perda de muitos epitopos sensveis a desnaturao.

Dificulta o acesso do anticorpo ao antgeno atravs do crosslinking de protenas podendo criar estruturas estveis que no vo permitir o acesso do anticorpo. Alm da precipitao de proteinas.

FIXAO

DESNATURAO PROTEICA

Interesse em manter uma boa estrutura do tecido e a preservao da antigenicidade.

Fixao com potentes desnaturantes proteicos vo render um tecido estvel com morfologia preservada, mas com destruio de muitos determinantes antignicos

Bloqueio da habilidade de um anticorpo se ligar a um antgeno

Ac detectam conformao das ptns

Anticorpos Policlonais - reagem com protenas nativas e com protenas desnaturadas

Anticorpos Monoclonais - Alguns reagem somente com protenas nativa e outros podem reagir apenas com ptns desnaturadas.

Produo de anticorpos atravs da imunizao de animais com antgenos que foram previamente fixados pelo mesmo processo de fixao dos tecidos.

REGRAS GERAIS PARA UMA BOA FIXAO 1. Fixe tecido o mais rpido possvel a retirada deste; 2. No fixe fragmentos com mais de 6 mm de espessura, pois o fixador possui capacidade de penetrao lenta, se o fragmento for muito espesso havera autlise no centro do tecido; 3. Evite: pinar, tracionar ou manipular em excesso os tecidos; 4. Use sempre um volume de fixador superior a 20 vezes o volume da pea. Volume penetrao insuficiente Fixao defeituosa 5. Fixe o material por um perodo de 6 a 24 horas, agitando o frasco esporadicamente;

6. Mantenha a pea sempre submersa no fixador; 7. Coloque a pea no fixador, no ao contrrio, evitando aderncia desta ao fundo; 8. Use recipiente de boca larga. O processo de fixao promove um "endurecimento". No use frasco de boca estreita, pois com o endurecimento da pea poder ser impossvel remov-la do frasco

Fixao Fsica
CALOR Alterao profunda dos tecidos Utilizado para fixao de bactrias e leveduras

Eventualmente em fixao de esfregaos

Utilizado para acelerar fixao qumica

FRIO Temperaturas baixssimas Impedir progresso da autlise Endurecimento de tecidos para execuo de cortes histolgicos

Necessrio criopreservao

Fixao Qumica
Fixador ideal: Possuir rpido poder de coagulao/preciptao e penetrao, conservar a estrutura natural da clula e possibilitar qualquer mtodo de colorao.

Os fixadores podem agir precipitando as protenas ou as coagulando, assim temos como principais fixadores: A) Que precipitam as protenas: cloreto de mercrio e cido pcrico; B) Que coagulam as protenas: aldedo frmico, tetrxido de smio e o aldedo glutrico.

 Formol
Aldedo frmico (gasoso) em soluo aquosa a 40% (Formol Puro)

Utilizado diludo em soluo aquosa a 10%

Fixador mais comumente utilizado na microscopia ptica

Age coagulando as protenas, interagindo com os aminocidos lisina e arginina. No preserva gorduras livres.

Tempo de fixao: lento , 8hrs: 1mm de espessura

extremamente voltil e provoca irritao dos olhos e vias respiratrias.

Pigmento de formol

Formol puro (formol 40% P.A.).............................100 ml gua Destilada...................................................900 ml Fosfato de sdio monobsico................................ 4,0 g Fosfato de sdio dibsico...................................... 6,5 g

 lcool etlico
Fixao de pequenos fragmentos de tecidos, atualmente, pouco empregado Precipita protenas sem coagul-las Fixao rpida Promove muitas alteraes celulares:

- agregados de clulas tendem a se contrair, formando grupos

celulares - citoplasma se contrai fortemente

- morfologia do ncleo distorcida

 Lquido de Bouin
Mistura de substncias fixadoras
Tempo de fixao: rpido, 4hrs: 1mm de espessura Age coagulando as protenas

Formol puro (formol 40% P.A.).............................100 ml gua Destilada....................................................300 ml cido actico glacial........................................... 20,0 ml cido picrico...................................................... saturao Desvantajoso para rgos hematopoiticos porque deforma as hemcias

Ruim para fotografias

 Acetona
Usada para fixao citolgica
Desidrata muito o tecido Tempo de fixao: rpido, 2hrs: 1mm de espessura

cido Actico
Um dos mais usados, em combinao com outros fixadores Desidrata muito o tecido Corrige a ao hidratante de outros fixadores, evitando artefatos No fixa as protenas citoplasmticas

Bom poder de penetrao

 Glutaraldedo
Dialdedo, promove ligaes cruzadas entre protenas Muito utilizado na microscopia eletrnica Alto poder de penetrao

cido smico
cido persmico ou tetrxido de smio Altamente voltil e txico Utilizado para fixar gorduras O tetrxido de smio e o glutaraldedo so os fixadores mais usados em microscopia electrnica, porque coagulam as protenas, causando modificaes mnimas na ultraestrutura celular.

Atividade fixadora do formol e do aldedo glutrico sobre a estrutura dos microtbulos que so constitudos pelo unio de molculas proteicas globosas, tubulina e (monmeros). Possuindo dois grupos aldedicos, cada molcula de cido glutrico liga-se a dois monmeros, mantendo o microtbulo polimerizado. O formol incapaz de manter essa polimerizao, pois cada molcula de formol apenas se liga a um nico monmero.

Alternativa... Perfuso intravascular

Volemia: 5 ml 100g