免疫 组化 与杂交 组

化
 第一 章 理论基础
theoretic basis

免疫组 织化学和杂 交组织

化学是 一门原位示 踪染色技术 。学科
交叉的 产物。
 理论基础是基于 利用放射
性核素 和其他标记 物（荧光 素，酶，
重金属 离子等）作 为示踪剂 ，通过免
疫亲和 （抗原 - 抗体特异性结合 ）和
核酸杂 交（碱基配 对特异性 连接）途
径，在 组织切片或 细胞涂片 上，原位
显示生 物大分子的 动态变化 而建立的
一门染 色技术。
 基本特点是 “特异 , 灵敏
，准确 ，形态、 机能、 代谢三 位
一体” ，系分子 病理学研究 的常用手
段。
 学习的重
点有四：

1. 名词概念；
2. 技术原理；
3. 操作要领；
4. 结果判断原则
（尤其 是对照染 色和假阳性 假阴性的判
别）。
 第一节 抗原

1. 抗原的概念 凡能 在机体内

引起体 液免疫和 / 或细胞免疫 反应的

物质 , 称为抗 原。
 抗原 主要具有两 方面的特

性，抗 原能引起机 体产生抗 体和 / 或

致敏淋 巴细胞，称 之为免疫 原性；

抗原还 与相应的抗 体及致敏 淋巴细胞

发生特 异性结合或 反应，称 为免疫反

应性。
 有免疫 原反应性而 缺乏免疫

原性的 抗原称为 半抗原，半 抗原与载

体（通 常是大分 子物质）结 合，可变

为全抗 原，载体 不仅增加半 抗原的大

小，可 在体内激 发免疫反应 ，而且还

直接与 免疫记忆 有关。

 2. 抗原的化学结构

一个天然抗原具 有二种

结构， 一是高分子 的载体（ 抗原性）

；二是 抗原决定簇 （特异性 ）。

 抗原决 定簇 （ antigenic
determinant ）又称抗原 表位（ epitope.) 是
指抗原 分子上具有 决定和控制 抗原特异 性
的特殊 化学基团 , 可与相 应抗体或淋 巴细
胞抗原 识别受体相 结合的部位 。大多数 蛋
白质抗 原可有多个 抗原决定簇 , 但由于 空
间位阻 作用 , 在同一时间 内仅有部分 抗原
决定簇 暴露和相应 的抗体结合 。
3. 抗原的 性质及种类 异性 ` 大分子

` 特异为抗原的 共同性质 ，凡种系越远

` 分子量越大 ` 构型越复杂 ` 抗原决定

簇暴露 越多，则其 抗原性越强 ，特异

性越高 。抗原的特 异性是临床 诊断 `

预防 ` 治疗的基础。
 抗原的类型 繁多，分类 方法也很

多，故 抗原的名 称各种各样 （表 1-1-

1 ）。 抗原有 可溶和不溶 性两类，后

者主要 包括一些 颗粒性抗原 ，如细胞 `

细胞器 ` 某些病原体 等。根据性 质，

抗原又 可分为：
 ① 结构抗 原，为组成 细胞结构的
成分， 如细胞骨 架蛋白； ② 分泌抗原
，为细 胞所产生 和分泌的酶 ` 激素 `
粘液蛋 白等； ③ 沉淀抗原， 如肾小球
肾炎时 ，沉淀在 肾小球基膜 的免疫球
蛋白 ` 补体和免疫复合 物等； ④入侵
抗原， 主要指病 原微生物。
4. 抗原分离纯化的一般原则

免疫组 化方法检测 的抗原中，

蛋白质 占了大多 数，故此处 叙述的

一般原 则以蛋白 抗原为主要 对象。

⑴ 首先选择和建立 抗原的检测 方法

目的是 跟踪监测一 系列提纯过程 中抗

原是否 存在，其含 量和活性如何 。方

法有特 异和非特异 之分，前者利 用抗

原的特 异反应，后 者利用抗原已 知的

理化特 性。
⑵ 选择抗原含 量高的组织 为材料

组织中欲 提抗原含 量越高，提

纯也越 容易，且得 率越高。

⑶ 操作中 应保持抗原 分子的稳定性

如低温 、严格 pH 、防止巯基 氧

化、在 缓冲液中加 入浓度

1―3×10ˉ 4 M 的 EDT A （乙二胺四 乙

酸）以 螯合除去重 金属离子、 防止蛋

白酶的 水解作用， 等等。

5. 抗原分离纯化的一般步骤
⑴ 增溶溶解 常用的 方法有 ①渗
透溶胞 ;② 研磨 ;③ 绞切 ;④ 超声波 ;
⑤ 挤压 , 等。

⑵ 分离纯化 原则是 《先粗后细

，先简 后繁，先盐 析后层析》。

⑶ 抗原纯 度的鉴定 方法有：琼

脂双扩 散、免疫电 泳、聚丙烯酰 胺凝胶
6. 常用的分离纯化方法 计有：

⑴ 差别溶解法 其中最常 用的是盐

析法， 又以中性盐 硫酸铵最为 常用。

 ⑵ 层析法 其中有①离 子交换层
析（ DE AE 、 CM 、 QA E 等）； ② 选择性
吸附层 析，如羟基 磷灰石可选择 性地吸
附中性 和酸性蛋白 而排除硷性蛋 白； ③
分子筛 层析（葡聚 糖凝胶）； ④亲和层
析。

⑶ 制备 电泳法 如 PAGE 制备电泳

 第二节 抗体
1. 抗体的 概念 抗体（ anti body ）是
机体通 过体液免疫 ，由 B 淋巴细 胞活化
、增殖 、分化的浆 细胞合成并分 泌与刺
激抗原 发生特异性 结合反应的免 疫球蛋
白（ im munog lobul in ， Ig ）。
 抗体是免疫 球蛋白，而 免疫球蛋

白不都 具有抗体活 性。两者在概 念上并

不完全 等同，抗体 是生物学和功 能上的

命名， 而 Ig 是结 构和化学本 质上的概

念。
2. 抗体 的基本结构

① 由于无抗体 话性的 Ig 一般很 少

见，故 抗体与 Ig 可认作为同 义词。人
类 Ig 有五类 ，即 IgA 、 IgD 、 Ig E 、
IgG 和 Ig M ，是由其分 子结构中 相应的
重链（ H 链）— α. δ. ξ. γ 和 μ 决定的。
重链不 同， Ig 的类型就不 同。轻链
（ L 链）则在同一抗 体分子（ Ig ）中
 若轻链不同表明 该 Ig 和抗体是杂
系、多 克隆的；反 之，轻链单 一、同型
则表示 该 Ig 或抗体是单克隆 的。

② Ig 单体的 基本结构是 由二条相同

的轻链 和二条相同 的重链组成 ，各自链
间（轻 –重或重– 重链）由二 硫键（–
S–S– ）相连接，呈 Y 字构型（图解
）
 ③ Ig 分子的 氨基酸构型 可分为可

变区（ N- 端）和恒定区（ C- 端）两 部

份。

⒊ 抗体的 特性

① Ig 都是大 分子蛋白质 ，既具有

免疫原 性，又具有 能与相应抗 原结合的

 ② 免疫原性的 类属特异 性是由 Ig

分子的 重链和轻链 恒定区特定的 氨基酸

序列所 决定，而免 疫原性的型属 特异性

（独特 性或遗传性 idio type ）则是 由

重链和 轻链可变区 特定的氨基酸 序列所

决定。 抗体活性位 点存在于 Ig 的可变

区。
酶切所 形成的片段 ―― Fa b 或

F （ ab’ ） 2 只保持抗体活性 ，而无

抗原活 性； Fc 段主要由 Ig 两条不完

整的重 链的恒定区 序列构成（ -S- S- 连

接）， 只具抗原或 免疫原活性 ，而无抗

体活性 。 Ig 结合补体或巨噬 细胞的位

点也存 在于 H- 链的恒定区 。
③ Ig 由 B 淋巴细胞衍 生的浆细胞 生成

，主要 以可溶性蛋 白的形式存 在于体液

中。

④ Ig 的主要生物学功 能有：特 异性结

合抗原 ；活化补体 ；结合 Fc 受体等。

⒋ 抗体的 种类

⑴ 依来源分━ ①免疫抗体 ；②天然

抗体； ③自身抗体 。

⑵ 依反应分━ ①完全抗体 ；②不完

全抗体 。

⑶ 依制剂 或制备方法 分—— ①多克

隆抗体 ；②单克隆 抗体；③基 因工程抗
体。
⒌ 抗体的 制备

⑴ 抗血清 （多克隆抗体— —针对同

一抗原 多个抗原决 定簇的抗 体）的制
备流程

① 免疫原 （抗原或 抗原 + 佐剂）

准备 。包括抗原的 抽提、纯 化和剂量
核算（ 1mg/ ml ）； 佐剂乳化 ；半抗
原的处 理等。
* 佐剂是一种 非特异免疫 增强剂 ，可增

强免疫 反应，提 高抗体效价 ，常用福

氏佐剂 由 85% 石蜡油和 15% 羊毛脂组

成（半 佐剂）， 如加卡介苗 (100 ml 佐

剂中含 卡介苗 20 0 mg ）则为 完全佐剂

（ FC A ）。一 般首次注射 时用其 1/2

体积与 等量抗原 进行乳化。

第二次 或第三次注 射时用不完全 佐剂

或不用 佐剂。判断 乳化是否充分 ，可

将一滴 乳化好的液 体滴在水面上 ，如

能长时 间保持园珠 形而不散开， 表示

乳化达 到要求。
* 半抗原的处理 半抗原只有 免疫反

应性而 无免疫原性 ，半抗原必须 与大

分子载 体结合才能 激发机体产生 抗体

，常用 的载体有血 兰蛋白、卵白 蛋白

、牛血 清白蛋白等 。两者交联的 方法

和原理 是：
 利用 -NH 2 ， -C OOH 等功能基团

，用戊 二醛或碳化 二亚胺（ R′-

N= C=N=R ″ ）作为交联剂可 将半抗原

结合到 载体上，其 结合比例为 5K D 结

合 5—25 个分子的小 肽，交联完 成后

，还必 须纯化与载 体结合的半抗 原。

② 动物的 选择 选择 什么动物来

免疫取 决于所需抗 血清的量，小 白鼠

只能提 供 1.0- 1.5ml 的血液，而 山

羊却能 提供好几升 ；其次看你有 多少

抗原用 于免疫动物 ，小白鼠不到 50

微克就 足够，而山 羊却要几毫克 ；

 另外，还要 考虑动物的 品系，免疫

动物与 提供抗原的 动物之间 的种系差

异越大 越好，比如 哺乳动物 的比较保

守的蛋 白抗原可选 择非哺乳 动物（鸡

）来制 备抗体。常 用的动物 有兔、羊

、马、 猪等，以兔 （新西兰 兔，要求

：年青 ，健壮，体 重在 2. 5 公斤左右

 ③ 免疫方法 * 途径： 可以肌肉、

静脉、 皮内、皮 下或腹腔注 射，一般

以皮内 注射效果 最好，多部 位比单部

位好， 大动物一 般不用腹腔 注射，颗

粒抗原 和使用佐 剂时不能 I. V. 。另外

还可用 淋巴结内 注射来免疫 ，此法可

大大减 少抗原用 量。
 * 次数及间隔 时间：次数 一般为 2- 3
次，首 次注射后 ， 10-1 5 天再加强 注
射，剂 量同首次 或为首次的 一半，用
不全佐 剂或不用 佐剂；至于 间隔时间
，一般 而言，动 物越大，间 隔越长，
豚鼠、 大鼠为 7- 8 天；兔子为 10-1 5
天；羊 为 14-2 8 天；有时 第三次注 射
的间隔 时间更长 些，效果更 好。
由于各 动物之间的 个体差异颇 大，故

应多免 疫几个动物 从中选择效 价高的

* 效价测定：常 用的方法 有“ 琼脂免

疫双扩 散、免疫电 泳、 EL ISA 、免疫

组化” 等方法。
* 放血或定期抽 血：兔子 和羊是从颈
动脉插 管来放血， 豚鼠和大鼠 则可从
心脏穿 刺抽血，小 鼠可采取眼 球摘除
来采血 ，鸡往往从 腋动脉取血 。血液
凝固后 ，及时离心 收集血清。 加叠氮
钠，分 装，低温保 存，也可加 一定的
保护剂 如牛血清白 蛋白、甘油 等。
 ⑵ 单克隆抗体 （针对单 一抗原决 定

簇的抗 体）的制 备流程—— 一般分

六个步 骤：

① 免疫动物 绝大多数 Mc Ab 是

用小鼠 的免疫活 性细胞与小 鼠的骨髓

瘤细胞 融合而 建立的杂交瘤细 胞所产

生的。 一般用腹 腔注射的途 径来免疫

可溶性 蛋白抗原 的剂量，最 低每次

1μg ，常用 10 -20μg/ 次，抗 原充足

时，可 用到每次 50μg ，但不 要超过

每次 200 μg ，总量 不超过 500μg ；

如抗原 为细胞， 每次用量为 10 6 个细

胞，一 般注射 2- 3 次，取尾静 脉血测

效价， 用效价高 的小鼠作细 胞融合。

 ② 细胞融合 常用聚乙二醇 （ PEG ）
作融合 剂， PEG 分子量为 10 00-
300 0 ，常用 15 00 ，其浓度为
50% （ W/ V ），如用离 心法融合， 则用
30% 的 PE G 。融合时， 骨髓榴细胞 与小
鼠脾细 胞的比例在 1 ： 4-1 ： 12 之间
，免疫 后的小鼠脾 赃约含 5×10 7
-2×10 8 个淋巴 细胞，每次 融合需骨髓
瘤细胞 2×10 7 ，融 合前培养细 胞的密
③ 选择培 养 常用 HA T （次黄嘌呤 -
氨甲蝶 呤 - 胸腺嘧啶核 苷）培养液 来进
行选择 培养，其原 理是 HA T 培养液抑制
细胞正 常途径的 DN A 合成， 由于骨髓瘤
细胞缺 乏次黄嘌呤 鸟嘌呤磷酸 核糖转移
酶（ HG PRT ）和胸腺嘧啶激 酶（ TK ）
，不能 进行补救途 径的 DN A 合成，在
HAT 培养液 中正常途径 DNA 合成被 抑制
后就无 法生存；
脾细胞 虽含有这两 种酶，在 HA T 培养液
中能够 生存，但没 有致裂原和其 它生长
因子， 脾细胞也不 能分裂；只有 脾细胞
和骨髓 瘤细胞融合 后生成的杂交 瘤细胞
，既有 这两种酶又 能无限制生长 ，在
HA T 培养液 中可顺利增 殖。但经选择 后
生长的 杂交榴可能 是多克隆的， 故必须
进行克 隆化。
④ 克隆化 常用方法有软 琼脂培养、

有限稀 释法、显微 操作法。 软琼脂培养

就是将 高度稀释的 杂交瘤细胞培 养在低

浓度的 琼脂中，单 个细胞增生后 可形成

界限清 楚的克隆， 将单个克隆挑 出进行

再培养 ；
有限稀 释法 ，即将 含一定数量 细胞的悬

液，经 多次倍比稀 释，直至于 96 孔培

养板的 每个孔可能 只含一个细胞 ，再进

行培养 ，但一次操 作常不能达到 目的，

一般要 重复三次以 上； 显微镜 法 是在显

微镜下 用微吸管吸 出单个细胞进 行培养。

 检验克隆化是否 成功， 判断的方法
是 ，当把一个产生 所需抗体的 阳性培养
孔中的 细胞经有限 稀释移至于 96 孔板
上生长 时，若所有 的孔都产生同 样的抗
体，说 明克隆化已 经完成；如部 分孔分
泌抗体 ，部分孔不 分泌抗体，说 明至少
有两个 不同的克隆 同时存在，还 需进一
步克隆 化。
⑤ 抗体 的检测 抗体检测的 目的是筛

选分泌 所需抗体的 单克隆杂交瘤 株，检

测的方 法应事先建 立。常用方法 有

EL ASA 法、放射免疫法 和免疫 组织化学

法等。
⑥ 扩大 培养 有两种途径， 一是体外

培养 ，其优点是可大 量生产，缺 点是培

养上清 液中单抗含 量低，仅 5-

40 μg/ml ，而且培养液中 常含血清，

纯化带 来麻烦，而 且长期培养污 染不易

控制；
二是体 内方法 ，即在 小鼠腹腔接 种杂交
瘤细胞 ，方法是先 用石蜡油腹腔 注射以
刺激腹 水产生，七 天后，在腹腔 中接种
地 10 7 的细胞（细 胞密度最 好在
2×10 7 /ml ）。体内方法的 优点是单抗
的浓度 高，可达 10 mg/ml 腹水， 还可定
期、持 续抽取腹水 ，并不易污染 ，缺点
是一旦 小鼠死亡或 患病，将一无 所得。
⑶ 基因工 程抗体的特 点和制备

基因工程抗 体又称重组 抗体，它 是

在充分 认识 Ig 基因结构与 功能基础上
，应用 DNA 重组技术和蛋白 质工程技术
，按照 客观需求 在基因水平 上对 Ig 分
子进行 切割、拼 接或修饰， 重新组装成
的新型 抗体分子 。特点是既 保留了天然
免疫抗 体的特异 性和主要生 物学活性，
6. 抗体的 纯化

抗体所在的 抗血清、腹 水或培养

液中， 其它成分甚 多，如要标记 抗体时
，必须 提纯抗体， 以免受杂蛋白 的干扰。
用不同 的方法，可 得到不同纯度 的抗体
：中性 盐盐析法只 能得到粗的 Ig G ；离
子交换 层析法（ DE AE-52 ）可得 到较纯
的 Ig G 组分；
 一般来 说，抗体 试剂的

纯度可 按以下制剂 顺序逐步递增 ：

全血清 或腹水 -γ 球蛋 白 -IgG （粗提

- 细提） - 特异性 抗体（免疫 纯

IgG ） - 特异性抗体 片段（ Fab 或

F （ ab´ ） 2 ）。
葡萄球 菌蛋白 A （ SP A ）亲和层析 法可

得到更 纯的 IgG 组分；而用抗原 亲和层

析柱进 行亲和层析 或用免疫沉淀 法则可

得到只 针对该抗原 的特异性 Ig G ；如再

将这特 异性的 IgG 用木瓜蛋白酶 或胃蛋

白酶进 行酶解，则 可得到特异性 抗体的

Fa b 片段。
段， 其中：
前者酶 解产生二分 子的 Fab 和一个完整

的 Fc 段，后者酶 解则产生 一个

F （ ab′ ） 2 和 Fc 段的碎片。 Fab 的

优点是 分子量小， 易渗透，而且 也可进

行标记 ，同时因无 Fc 段， 可消除抗体

与具有 Fc 受体的 无关细胞 的结合，从

⑶ 基因工 程抗体的特 点和制备

基因工程抗 体又称重组 抗体，它 是

应用 DNA 重组技 术和蛋白质 工程技术

制备的 抗体，特 点是 ：①无 种系异源

性，不 会诱发宿 主的免疫反 应；②能

直接制 备人源性 的抗体；

 ③ 不仅保持鼠 源性单抗 的特异性和

亲和力 等优点， 而且其免疫 作用更强

；④应 用范围加 宽，使用途 径增多，

针对性 更强，可 广泛应用于 免疫学研

究和肿 瘤的免疫 基因治疗； ⑤可作为

建立“ 抗体库” 的筛选试剂 。

 *“ 抗体库 （ anti bodic ba nk ）

” 是指通过将 某种生物体 的所有抗体

可变区 基因克隆 在质粒或噬 菌体中表

达，再 利用不同 的抗原与其 反应，从

而筛选 出携带特 异抗体基因 的克隆，

并由此 而获得相 应的高亲和 力特异性

抗体的 一项基因 工程技术。

 第三节 补体系统

⒈ 补体（ com pleme nt ）的概念 补

体是一 类存在于人 和动物血清 中具有

酶活性 、 能与任 何抗原抗体 复合物发

生结合 反应的复合 蛋白质。

⒉ 补体的 性质 补体由 9 个成分 11 种血清
蛋白质 组成，即 C1┄C9 及 C1q 、 C1r 和
C1s 。 C1q 可通过两种激活 途径即经典 激
活途径 和旁路激活 途径，并 按一定的补 体
激活顺 序呈现连锁 的酶促反 应，最终成 为
一种化 学介质或免 疫效应物 质参与机体 的
免疫病 理过程。在 免疫组化 工作中，主 要
作为制 备证明有无 免疫复合 物存在的桥 连
 第四节 核酸
⒈ 核酸 是组成一切生物 细胞生命活 性
物质的 基本成分 ，由多个核 苷酸分子
连接而 成，为此 ， 核酸又 叫多聚核苷
酸 。核酸是由 碱基 、 戊糖和磷酸三种
成分组 成的大分 子化合物， 可分二大
类：去 氧核糖核 酸（ DNA ）及核糖核
酸（ RNA ）。
⒉ DNA 主要以 双股链存在 于细胞核内

，其基 本成分为 碱基

（ A 、 G 、 T 、 C ） 、去氧 戊（核）

糖及磷 酸。 DN A 的分子结构 有三级 ：

一级结 构为 长核苷酸单链 ；二级结构

为双股 核苷酸链 组成的 双螺旋模型 ；

三级结 构为 超螺旋 结构。

DNA 的复制 和转录均是 在其双股 链解聚

成单链 后，按照 碱基互补规 律（ A-

G ， T-C ， G-A ， C- T 或 U-C ， C-

U） 进行的。链 间的氢键能 量相对较

低，体 外高温即 可解链，这 是核酸杂

交的理 论基础。
⒊ 核糖核 酸（ RNA ） 主要存在于细

胞浆内 ，以单链 的形式存在 ，由碱基

（ A 、 G 、 U 、 C ）、戊糖 和磷酸分

子所组 成，依其 功能可分为 四类： 转

运核糖 核酸（ tR NA ）、信使核糖核 酸

（ mR NA ）、核蛋白 体核糖核酸
① tRNA 在细胞 内含量居中 ，分子量

较小， 半衰期 24 h 以上，细胞 含量居

中，是 遗传信息 翻译成蛋白 质合成语

言（氨 基酸）的 执行者，主 要通过其

反密码 子与 mR NA 的相应密码子碱 基配

对，从 而对模板 mRN A 携带的遗传 信息

② mRNA 是基因（ DNA 的一个片断
）遗传 信息的转 录付本，蛋 白质合成
的模板 ，也是基 因转录和表 达功能检
测的靶 目标。其 结构特点是 分子量相
对较小 ，性质极 不稳定，半 衰期很短
（几分 钟至数小 时），细胞 内含量最
少，杂 交检测样 本组织要求 必须新鲜
。
 ③ rRNA 存在于粗面内质 网表面的
核蛋白 体（ ri bosom e ）中，分子 量较
大，是 细胞内含 量最丰富的 RNA ，起
执行蛋 白质合成 的“ 场所”和“ 装
配机” 的功能。

④ snRN A 存在于细胞 核内的一

类分子 量相对较 小的核 RN A ，含量微
、 种类多，

其功能 可能与基 因转录产物

第五节 DNA 的变性 与复 性

⒈ DNA 变性 是指其双螺旋之 间氢键

断裂， 即双股链 解聚成单链 的过程，

体外条 件下，高 温（ 94°C ）、改变

溶液 pH 值或加 入有机溶剂 均可使 DNA

变性。
⒉ DNA 复性 是指在一定条 件下（温

度缓慢 冷却至 55 。
C 左右） ， 变性解

聚的二 条互补单 链又重新结 合，恢复

原来的 双螺旋结 构的过程， 称为复性

（ re natur ation ）这一 过程又叫退

火（ ann eal ）。
 第六 节 质粒 与引 物
⒈ 质粒 pl asmid ） 为细菌 染色体外
的小型 双链环状 的 DNA ，由于拥有特
定的抗 生素筛选 序列和酶切 位点，常
用来作 为克隆或 重组真核细 胞 DNA
（包括 制备特异 性核酸探针 在内）的
载体。 质粒种类 繁多，常用 的有大肠
杆菌质 粒 pBR3 22 等。
⒉ 引物（ pr imer ） 指 PC R 扩增特异
性核酸 （ DNA 或 mR NA ）序列时，在其
两侧能 与对应的模 板链互补的寡 核苷酸
链。应 用时一般要 求成对，彼此 序列方
向相反 （ 3′→5′ ， 5′→3′ ），目
的在于 限定 PCR 扩增产物（ DN A 或
mR NA 序列）的特 异性和长度 ，是一种
PC R 扩增反 应的关键试 剂。