Aminocidos y Pptidos

Aminocidos Anlisis de Pptidos Sntesis de Pptidos

AMINOCIDOS Y PPTIDOS

Pedro Antonio Garca Ruiz

Catedrtico de Escuela Universitaria Area Qumica analtica Profesor Titular de Universidad Area Qumica Orgnica

Departamento de Qumica Orgnica - Universidad de Murcia

Aminocidos y Pptidos
Aminocidos Anlisis de Pptidos Sntesis de Pptidos

Aminocidos
Propiedades inicas Identificacin de aminocidos

Reacciones de los aminocidos

Produccin de aminocidos

Aminocidos
Name Alanine Arginine Asparagine Aspartic acid Cysteine Glutamine Glutamic acid Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanin Proline Serine Threonine Tryptophan Symbol A, Ala R, Arg N, Asn D, Asp C, Cys Q, Gln E, Glu G, Gly H, His I, Ile L, Leu K, Lys M, Met eF, Phe P, Pro S, Ser T, Thr W, Trp Mass(-H2O) 71.079 156.188 114.104 115.089 103.145 128.131 129.116 57.052 137.141 113.160 113.160 128.17 131.199 147.177 97.117 87.078 101.105 186.213 Side Chain Occurrence (%) CH37.49 HN=C(NH2)-NH-(CH2)35.22 H2N-CO-CH24.53 HOOC-CH25.22 HS-CH21.82 H2N-CO-(CH2)24.11 HOOC-(CH2)26.26 H7.10 N=CH-NH-CH=C-CH22.23 |______________| CH3-CH2-CH(CH3)5.45 (CH3)2-CH-CH29.06 H2N-(CH2)45.82 CH3-S-(CH2)22.27 Phenyl-CH23.91 -N-(CH2)3-CH5.12 |_________| HO-CH27.34 CH3-CH(OH)5.96 Phenyl-NH-CH=C-CH21.32 |_____________|

Punto isoelctrico
H3O H 3N CH COOH R HO

Aminocidos
H 3O H3N CH COO R HO H2N CH COO R

pH en el punto isoelctrico = pI = (pk1+pk2) Dos grupos cidos Tres pk Dos grupos amino Asprtico, glutmico, tirosina, p-hidroxifenilalanina, cisteina pI = (pk1+pk2) Lisina, arginina

H3N CH COOH (CH2)3 COOH

H3O HO

H3N CH COO (CH2)3 COOH

H3O HO

H3N CH COO (CH2)3 COO

H3O HO

H2N CH COO (CH2)3 COO

k1

k2

k3

Punto isoelctrico
H3O H 3N CH COOH R HO

Aminocidos
H 3O H3N CH COO R HO H2N CH COO R

pH en el punto isoelctrico = pI = (pk1+pk2) Dos grupos cidos Tres pk Dos grupos amino Asprtico, glutmico, tirosina, p-hidroxifenilalanina, cisteina pI = (pk1+pk2) Lisina, arginina pI = (pk2+pk3)
H3O HO H2N CH COO (CH2)4 NH3 H3O HO H2N CH COO (CH2)4 NH2

H3N CH COOH (CH2)4 NH3

H 3O HO

H3N CH COO (CH2)4 NH3

k1

k2

k3

R =H

Glicina Smbolo: G, Gly pK1=2,34 pK2=9,60 pI=5,97

R hidrfobo

Alanina Smbolo: A, Ala

CH3
CH NH2 C O OH

H
C O OH

pK1=2,34 pK2=9,69 pI=6,00 Abundancia: 7.49

CH NH2

Abundancia: 7.10

R polar (+) a pH=7 Arginina

NH C NH2 NH CH2 CH2 CH2

R polar
O C NH2 CH2

Asparragina Smbolo: N, Asn pK1=2,02 pK2=8,80 pI=5,41 Abundancia: 4.53

CH NH2 C O OH

Smbolo: R, Arg pK1=2,17 pK2=9,04 pK3=12,48 pI=10,76

CH NH2 C O OH

Abundancia: 5.22

R polar (-) cido asprtico a pH=7 Smbolo: D, Asp pK1=1,88 COOH pK2=3,65 CH2 pK3=9,60 pI=2,77 CH NH
2

R polar (-) a pH=

SH CH2

Cisteina Smbolo: C, Cys

C O Abundancia: 5.22 OH

pK1=1,96 pK2=8,18 CH NH2 pK3=10,28 C O pI=5,07 OH Abundancia: 1.82

R polar O
C NH2 CH2 CH2
CH NH2 C O OH

Glutamina Smbolo: Q, Gln pK1=2,17 pK2=9,13 pI=5,65

R polar(-) a pH=7 cido glutmico

O C OH CH2 CH2

Smbolo: E, Glu pK1=2,19 pK2=4,25 pK3=9,67 pI=3,22 Abundancia: 6.26

CH NH2 C O OH

Abundancia: 4.11

R polar (+) Histidina a pH=7 Smbolo: H, His pK1=1,82 N pK2=6,00 NH pK3=9,17 pI=7,59 CH NH2
C O OH

R hidrfobo
CH3 CH2 CH CH3

Isoleucina Smbolo: I, Ile pK1=2,36 pK2=9,68 pI=6, Abundancia: 5.45

CH NH2 C O OH

Abundancia: 2.23

R hidrfobo

Leucina

CH3 CH CH2
C O OH

Smbolo: L, Leu pK1=2,36 CH3 pK2=9,60 pI=5,98

R polar (+) a pH=7

NH2 CH2 CH2 CH2 CH2

Lisina Smbolo: K, Lys pK1=2,18 pK2=8,95 pK3=10,53 pI=9,74 Abundancia: 5.82

CH NH2

CH NH2 C O OH

Abundancia: 9,06

R hidrfobo
CH3 S CH2 CH2
CH NH2 C O OH

Metionina

R hidrfobo

Fenil alanina Smbolo: eF, Phe pK1=1,83 pK2=9,13 pI=5,48 Abundancia: 3,91

Smbolo: M, Met pK1=2,28 pK2=9,21 pI=5,74

CH2
CH NH2 C O OH

Abundancia: 2,27

R hidrfobo

Prolina

R polar
OH CH2
CH NH2 C O OH

Serina Smbolo: S, Ser pK1=2,21 pK2=9,15 pI=5,68 Abundancia: 7,34

CH2 CH2

Smbolo: P, Pro pK1=1,99 pK2=10,60 pI=6,30

CH C O OH

NH

Abundancia: 5,12

R polar

Treonina Smbolo: T, Thr pK1=2,09 pK2=9,10 pI=5,60

R hidrfobo
NH

Triptofano Smbolo: W, Trp pK1=2,83 pK2=9,39 pI=5,89 Abundancia: 1.32

CH3 CH OH
CH NH2 C O OH

CH NH2 C O OH

Abundancia: 5,96

R polar (-) a pH= Tirosina R hidrfobo

Valina Smbolo: V, Val pK1=2,32 pK2=9,62 pI=5,96 Abundancia: 6.48

OH

CH NH2 C O OH

Smbolo: Y, Tyr pK1=2,20 pK2=9,11 pK3=10,07 pI=5,66

CH3 CH3 CH
CH NH2 C O OH

Abundancia: 3.25

Aminocidos
Propiedades inicas Identificacin de aminocidos

Reacciones de los aminocidos

Produccin de aminocidos

Identificacin de aminocidos
Extraccin de aminocidos libres Determinacin de aminocidos libres totales Separacin de aminocidos Tcnicas espectroscpicas

Disolventes Purificacin

Identificacin de aminocidos
Extraccin de aminocidos libres Determinacin de aminocidos libres totales Separacin de aminocidos Tcnicas espectroscpicas

Mtodo del N-formol Mtodo del cido nitroso Mtodo de la ninhidrina

Mtodo del N-formol Para formar la imina y bloquear el grupo amino

H H C N CH COOH H R

C O + H2N CH COOH H R

Desaparece el carcter anftero del aminocido y puede valorarse con NaOH y fenolftaleina. Este mtodo de valoracin de aminocidos libres totales se emplea para valorarlos en piensos, hidrolizados de protenas y lquidos biolgicos

Identificacin de aminocidos
Extraccin de aminocidos libres Determinacin de aminocidos libres totales Separacin de aminocidos Tcnicas espectroscpicas

Mtodo del N-formol Mtodo del cido nitroso Mtodo de la ninhidrina

Mtodo del cido nitroso Con cido nitroso los aminocidos desprenden nitrgeno

HO N

+ H2N CH COOH
R

HO N

CH COOH R

N2 +

HO

CH COOH R

La medida del volumen de nitrgeno desprendido permite calcular la cantidad de aminocidos totales.

Identificacin de aminocidos
Extraccin de aminocidos libres Determinacin de aminocidos libres totales Separacin de aminocidos Tcnicas espectroscpicas

Mtodo del N-formol Mtodo del cido nitroso Mtodo de la ninhidrina

Mtodo de la ninhidrina Hidratode triceto hidrindeno Los aminocidos dan color azul-violeta con la ninhidrina
O OH OH O O H CO O N O O H CO O N O CH R CH R O O O N CH COOH R O O + H2N CH COOH R

O H CH NH2 R

H2O

Cualquier aminocido al reaccionar origina el mismo producto de reduccin de la ninhidrina

Mtodo de la ninhidrina Hidratode triceto hidrindeno Los aminocidos dan color azul-violeta con la ninhidrina
O H NH2 O O

+ O
O

Cualquier aminocido da el aducto azul violeta

O H O

O H N O

Cualquier aminocido al reaccionar origina el mismo producto de reduccin de la ninhidrina

Identificacin de aminocidos
Extraccin de aminocidos libres Determinacin de aminocidos libres totales Separacin de aminocidos Tcnicas espectroscpicas

G.L.C.-M.S. H.P.L.C.-UV (I.R.) H.P.L.C. Otras

Identificacin de aminocidos
Extraccin de aminocidos libres Determinacin de aminocidos libres totales Separacin de aminocidos Tcnicas espectroscpicas

R.M.N. O.R.D.-C.D. Otras

Aminocidos
Propiedades inicas Identificacin de aminocidos

Reacciones de los aminocidos

Produccin de aminocidos

Reacciones de los aminocidos

Esteres metlicos y etlicos Esteres benclicos Formacin de amidas

Suspensin el el alcohol con HCl anhidro del aminocido. El ester se asla por cristalizacin como clorhidrato

CH2 CH

COO

CH3OH HCl

CH2 CH

CO OCH3 Cl

NH3

NH3

Fenil alanina

90%

Reacciones de los aminocidos

Esteres metlicos y etlicos Esteres benclicos Formacin de amidas

Alcohol benclico con bencenosulfonato o tosilato como catalizador. El agua se elimina por destilacin azeotrpica

CH 2OH

SO3H

H3N CH2 COO

Glicina

SO3 H 3N CH 2 CO O CH2

90%

Reacciones de los aminocidos

Esteres metlicos y etlicos Esteres benclicos Formacin de amidas Los esteres bencilicos como grupos protectores de fcil eliminacin.

Cl

H 3N CH 2 CO O CH2

H2/Pd
CH3

Cl

H3N CH2

COOH

Reacciones de los aminocidos

Esteres metlicos y etlicos Esteres benclicos Formacin de amidas

Preferentemente en medio bsico y con cloruros de cido. Por ejemplo cloruro de benzoilo y sosa concentrada en agua.

H3N CH COO CH3 CH COCl CH3

4C 2h

HO
H 2O

CO HN CH COO CH3 CH CH3

CO HN CH COOH CH3 CH CH3

HCl

Reacciones de los aminocidos

Esteres metlicos y etlicos Esteres benclicos Formacin de amidas
H3N CH COO CH2 NH N

Tambin por reaccin con anhdrido actico

CH3 CH3 C O C CH 3 O O

C HN CH COOH O CH 2 NH

100C 2h

80%

Histidina

Aminocidos
Propiedades inicas Identificacin de aminocidos

Reacciones de los aminocidos

Produccin de aminocidos

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

cido glutmico -350.000 ton/ao Metionina -120.000 ton/ao Lisina -35.000 ton/ao

Otros entre 50 y 500 ton/ao

Produccin industrial
Aminocido Alanina valina leucina isoleucina metionina prolina fenilalanina triptfano serina Treonina cisteina tirosina asparragina glutamina Ac asprtico Ac glutmico Lisina Arginina Histidina L 14.00 13.25 8.25 28.00 7.25 17.00 13.50 22.00 22.00 29.00 15.00 7.90 6.00 6.50 2.95 1.25 2.85 6.00 12.00

Precios en 1983 en $ por 100g

D 91.00 89.00 160.00 7500.00 65.00 1430.00 76.00 62.00 100.00 100.00 1840.00* 510.00 33.50 710.00 47.00 110.00 460.00 690.00 250.00 Racemato 3.00 5.00 5.25 18.00* 1.40 168.00 12.75 15.00 8.75 20.00 210.00* 44.80 6.00 2.85 7.00 9.90 90.00 30.00

Produccin industrial
Aminocido Alanina valina leucina isoleucina metionina prolina fenilalanina triptfano serina Treonina cisteina tirosina asparragina glutamina Ac asprtico Ac glutmico Lisina Arginina Histidina L 14.00 13.25 8.25 28.00 7.25 17.00 13.50 22.00 22.00 29.00 15.00 7.90 6.00 6.50 2.95 1.25 2.85 6.00 12.00

Precios en 1983 en $ por 100g

D 91.00 89.00 160.00 7500.00 65.00 1430.00 76.00 62.00 100.00 100.00 1840.00* 510.00 33.50 710.00 47.00 110.00 460.00 690.00 250.00 Racemato 3.00 5.00 5.25 18.00* 1.40 168.00 12.75 15.00 8.75 20.00 210.00* 44.80 6.00 2.85 7.00 9.90 90.00 30.00

Produccin industrial
Aminocido Alanina valina leucina isoleucina metionina prolina fenilalanina triptfano serina Treonina cisteina tirosina asparragina glutamina Ac asprtico Ac glutmico Lisina Arginina Histidina L 14.00 13.25 8.25 28.00 7.25 17.00 13.50 22.00 22.00 29.00 15.00 7.90 6.00 6.50 2.95 1.25 2.85 6.00 12.00

Precios en 1983 en $ por 100g

D 91.00 89.00 160.00 7500.00 65.00 1430.00 76.00 62.00 100.00 100.00 1840.00* 510.00 33.50 710.00 47.00 110.00 460.00 690.00 250.00 Racemato 3.00 5.00 5.25 18.00* 1.40 168.00 12.75 15.00 8.75 20.00 210.00* 44.80 6.00 2.85 7.00 9.90 90.00 30.00

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica Poca importancia econmica por difcil separacin Hasta aos 50 glutmico por hidrlisis del gluten Hoy mezclas de hidrolizados (poco importantes)

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Aminacin de -halo cidos Va sntesis de Gabriel Via sntesis de Strecker

Acido L-glutmico L-lisina L-metionina

Aminacin de -halo cidos Hell-Volhard-Zelinsky Es la forma ms inmediata de introducir un grupo amino en a un cido carboxlico
CH3 H C H COOH H Br Br2 + PBr3 CH3 H C Br COOH

80%

Vlido para: glicina, alanina, serina, treonina, valina, leucina, nor leucina.

25C NH 3 4 dias H 2O H Br
CH3 H C NH3 COO

Rendimientos relativamente bajos

56%

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Aminacin de -halo cidos Va sntesis de Gabriel Via sntesis de Strecker

Acido L-glutmico L-lisina L-metionina

Va sntesis de Gabriel

2-bromomalonato de dietilo con ftalimida potsica

O C
K Br

O C N C O K

OEt CO H C Br CO OEt

OEt CO N C H CO OEt

85%

EtONa

O C N C O

OEt CO C R CO OEt

OEt CO N C CO OEt Na

RX

X Na

C O

Va sntesis de Gabriel

2-bromomalonato de dietilo con ftalimida potsica

O OH CO N C R CO OH

O C N C O

OEt CO C R CO OEt

H2O
H 3O

Vlido para muchos aminocidos.

C O

CO2

O C OH C O OH H3N H C R CO O

H2O
H 3O

C N C O

H C R CO OH

Glicina (R=H)85%

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Aminacin de -halo cidos Va sntesis de Gabriel Via sntesis de Strecker

Acido L-glutmico L-lisina L-metionina

Via sntesis de Strecker

Aldehdos y cianuro en presencia de amoniaco

H CN NH2 R C CN H
H 3O

R C

O H

NH3
H 2O

R C

NH H

NH3 R C COO H

Alanina (R=H)55%

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Aminacin de -halo cidos Va sntesis de Gabriel Via sntesis de Strecker

Acido L-glutmico L-lisina L-metionina

Sntesis del cido L-glutmico

N C CH CH2
N C CH2 CH2 CHO

Hidroformilacin de acrilonitrilo y sntesis de Strecker

N C CH2 CH2 H C NH2 C N

CO + H2

NH 3
H 2O

H CN

H 3O

O C OH CH2 CH2 H C NH3 C OH O

Cat = Co

El cido glutmico es el principal ingrediente de las pastillas de caldo y de sopas en polvo. Tiene sabor a carne y se dice que refuerza el sabor de los otros ingredientes

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Aminacin de -halo cidos Va sntesis de Gabriel Via sntesis de Strecker

Acido L-glutmico L-lisina L-metionina

Sntesis de L-lisina

Cianoetilacin de acetaldehido, sntesis de hidantoina e hidrogenacin cataltica

CH2 CH 2 HC O CH 2 C N
H CN

CH 3

OR

HC O H 2C C C N

Industria solo 3 pasos

CH2 CH2 CH OH N C

CH2

C N CH2 CH2 CH NH2

H CN

CO2

NH3
CH 2 CH 2 CH NH CH2 C N

NH3
O C

CH2

C N O C

CO2

hidantoina
O

NH2
H2

NH
H 2O

C
H2

CH 2 CH 2 CH NH O C NH C O

CH2

CH2 NH 2
H 2O

CH2 CH2 CH NH2 O C OH

CH2

CH2 NH2

Sntesis de L-lisina
NH2 CO OH

A partir de caprolactama o cido -amino caproico va halogenacin en

NH CO CO Cl CO OH NH CO CO Br OH

Br2

NH3
NH3 CO NH3 OH
H2O

H 3O

NH CO CO NH2 OH

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Aminacin de -halo cidos Va sntesis de Gabriel Via sntesis de Strecker

Acido L-glutmico L-lisina L-metionina

Sntesis de L-metionina

A partir de acrolena metanotiol a travs de metilmercaptoetilhidantoina

CH 2 CH3 SH CH2 CH2 S CH3
H CN

CH 3 CH

CH2

Oxid

O CH CH

CH2 CH 2 S CH3

NH3

CH C N

CO2 O H
CH2 CH2 S CH3 CH C O NH NH C O
H 2O
CO3K2

CH

CH2 CH2 S CH3 CH C O OK NH2

hidantoina

L-metionina se consume a gran escala para enriquecer piensos compuestos

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Conversin en diasteroismeros Destruccin de un enantimero Transformacin de un enantimero

Conversin en diasteroismeros Proteger el grupo amino en forma de amida y tratar el producto resultante con un enantimero de una amina quiral. Los diasteroismeros que se obtienen se separan por solubilidad o cristalizacin fraccionada Rendimientos bajos Recristalizaciones sucesivas Difcil predecir que diasteroismero ser ms soluble o que amina quiral interesa. Reactivos caros que se consumen

Conversin en diasteroismeros
H H3N C COO CH3 CH CH3 HCOOH O O H CH HC HN C COO CH3 CH3

Resolucin de DL-valina
O H BH CH HC HN C COO CH3 CH3 COO H CH3 CH BH

COO H 3N C CH3 CH H CH3

COO H CH3 O CH

BH
B = Brucina

HC HN C CH 3 H

HC HN C CH3

80%
H BH CH

70%

H3N C COO CH3 CH CH3

NaOH
OC

H 2O

HC HN C COO CH3 CH3

Cristalizacin fraccionada
BH

COO

COO H CH

70%

H 3N C CH3 CH

H CH3

NaOH H 2O
OC

HC HN C CH3

CH3

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Conversin en diasteroismeros Destruccin de un enantimero Transformacin de un enantimero

Destruccin de un enantimero Resolucin biolgica Se alimenta un animal o microorganismo con el racemato, metaboliza el L (normalmente) y se asla el D del medio de cultivo o orina del animal Poco til y solo para preparar el D Resolucin enzimtica D-aminocido oxidasa del rin L-aminocido oxidasa de la serpiente de cascabel Destruyen un ismero y no el otro. Tambin poco rentable

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

Conversin en diasteroismeros Destruccin de un enantimero Transformacin de un enantimero

Transformacin de un enantimero Resolucin cintica Una enzima convierte un enantimero en otro producto y despus de separados pueden recuperarse ambos. Ejemplo: La acilasa renal del cerdo cataliza la hidrlisis de los enlaces amida pero es especfica para las amidas de los Laminocidos DL-leucina
AcOAc

N-acetil-DL-leucina acilasa renal del cerdo

N-acetil-D-leucina

L-leucina

Produccin de aminocidos
Produccin industrial Hidrlisis de protenas Sntesis qumica Resolucin de racematos Sntesis microbiolgica o enzimtica

La fabricacin de productos qumicos mediante microorganismos es una de las ramas de la Biotecnologa Acido L-glutmico y L-lisina Una cepa bacteriana se cultiva en un tanque con azcar y se aade aire y amoniaco manteniendo el pH y temperatura en rangos. fisiolgicos Con Corynebacterium Glutamicum, por cada kilo de glucosa se obtiene kilo de cido L-glutmico L-lisina tambin se obtiene por fermentacin

Biosntesis de aminocidos A partir de amoniaco y carbohidratos (-cetocidos) se sintetizan en el organismo en presencia de enzimas reductoras Sntesis de glutmico Aminocidos O O H esenciales: C Arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano y valina. Sntesis de aminocidos
O

NH 3

O O

H3N

C O O

L-glutamato deshidrogenasa

C O O

-cetoglutarato

Ac. glutmico

COO C R NH 3 H
transaminasa

COO R C O
-cetocido

L-aminocido

Aminocidos y Pptidos
Aminocidos Anlisis de Pptidos Sntesis de Pptidos

Anlisis de Pptidos
Esterificacin Hidrlisis Degradacin en una etapa Degradacin secuencial Otros mtodos de secuenciacin HCl 6N a 105C (no bases por racemizacin) Triptofano se destruye en la hidrlisis Glutamina y asparragina dan amoniaco y cidos glutmico y asprtico Anlisis: bsicos (pH=5,3),neutros (pH=4,25), cidos (pH=3,25),

Anlisis de Pptidos
Esterificacin Hidrlisis Degradacin en una etapa Degradacin secuencial Otros mtodos de secuenciacin Se identifica el NH2 terminal el COOH terminal con un grupo identificable y no hidrolizable. Se hidroliza el pptido marcado Se identifica el aminocido terminal

Anlisis de Pptidos
2,4-dinitrofluorbenceno
NO2 NO2 F

Degradacin en una etapa

Reactivos para identificar NH2 terminales FDNB

NO2 NO2

Sanger
COOH R C H

Despus de la hidrlisis
Amarillo, se extrae con cloroformo (los dems productos de hidrlisis ionizados no se extraen)

NH

Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo Cloruro de dansilo

CH 3 CH 3 N O S Cl O

DNS-Cl

Despus de la hidrlisis CH3

CH3 N O S O

COOH R NH C H

Anlogo a FDNB pero fluorescente (detecta cantidades mnimas)

Anlisis de Pptidos
Reduccin con borohidruro de litio

Degradacin en una etapa

Reactivos para identificar COOH terminales BH4Li

CH2OH R NH 2 C H

Despus de la hidrlisis BH4Li

Se separa el amino-alcohol en medio bsico (los dems ionizados y l no)

Hidrazinolisis

NH2-NH2 Despus de la hidrlisis

NH2-NH2

CO NH NH2 R NH2 C H

COOH R NH2 C H

El terminal queda libre y los dems como hidracidas

Anlisis de Pptidos
Esterificacin Hidrlisis Degradacin en una etapa Degradacin secuencial Otros mtodos de secuenciacin Permiten la identificacin sucesiva de los aminocidos, utilizando una sola muestra de pptido El mtodo ms utilizado es el de Edman Identifica un amino terminal y deja el resto del pptido intacto para repetir el proceso

Anlisis de Pptidos
S N C

Degradacin secuencial Degradacin de Edman

H NH CH CO NH CH CO R1 R2

NH CH COOH R3

1) Adicin en medio bsico de isotiocianato de fenilo

H S N C NH

CH CO NH CH CO R1 R2

NH CH COOH R3

2) Hidrlisis suave solo del terminal con HCl en CH3NO2 Actico

Mejora de este es soportar mediante el COOH a un polmero el pptido e ir degradando secuencialmente

HOO C O + C H CH R1 S CH R1 N N NH C NH C
S

NH2

CH CO R2

NH CH COOH R3

Puede repetirse el proceso con el resto hasta 30 ms veces si el pptido es grande

Tiohidantoina

Anlisis de Pptidos
Esterificacin Hidrlisis Degradacin en una etapa Degradacin secuencial Otros mtodos de secuenciacin

Espectrometria de masas Resonancia magntica nuclear

Aminocidos y Pptidos
Aminocidos Anlisis de Pptidos Sntesis de Pptidos

Sntesis de Pptidos
Introduccin, dificultades y secuencia Bloqueo del grupo amino Bloqueo del grupo carboxilo Activadores del grupo carboxilo Sntesis en fase slida

Sntesis de Pptidos
Importancia cientfica Importancia tecnolgica Facilidad aparente
R C O
SOCl2

Introduccin, dificultades y secuencia

La obtencin de un enlace amida es fcil por ejemplo:

R C

R NH2

R C R

OH

Cl

NH

No puede emplearse pues al ser un aminocido polimeriza.

R C O

OH

R NH2

Deshidratante

R C R

NH

Tampoco puede emplearse por reacciones secundarias.

Sntesis de Pptidos
Importancia cientfica Importancia tecnolgica Facilidad aparente Dificultades
C R

Introduccin, dificultades y secuencia

COOH H

COOH C R NH2 H

NH2

1) Si entre dos aminocidos distintos cuatro dmeros posibles

COOH C R NH CO C R NH2 H R H R

COOH C NH CO C NH2 H R H R

COOH C NH CO C NH2 H R H R

COOH C NH CO C NH2 H H

Sntesis de Pptidos
Importancia cientfica Importancia tecnolgica Facilidad aparente Dificultades
R H O C C NH
C R

Introduccin, dificultades y secuencia

COOH H

COOH C R NH2 H

NH2

Condiciones enrgicas Lenta

NH C O C R H
R COOH

2) Hay que activar los grupos reaccionantes para condiciones suaves.

Rpida

C R NH CO C

2,5-dicetopiperazina

NH2

Sntesis de Pptidos
Importancia cientfica Importancia tecnolgica Facilidad aparente Dificultades DR H C C O O N C C NH2 R H R H

Introduccin, dificultades y secuencia

COOH C NH2 H
H H X X R R C C C C O O H H N N C C O O B

COOH C R NH2 H R

C C

Medio bsico

NH2 NH2

R R H H

Enol no quiral
N C O C O C C NH2 R H

LH

R C C O

N C O C NH2 R H

3) Hay que evitarla racemizacin de los centros quirales y por ello los medios fuertemente bsicos que generan oxazolonas.

Sntesis de Pptidos
Importancia cientfica Importancia tecnolgica Facilidad aparente Dificultades Secuencia
COOH C R NH CO C R H H

Introduccin, dificultades y secuencia

1) Proteger el COOH deseado

COOH X C R H
R COOH C NH2 H

NH2 Z

2) Proteger el NH2 deseado 3) Activar el COOH como COX 4) Realizar la reaccin

Y
COOH X C R H

5) Desproteger el NH2 del pptido 6) Aadir un nuevo aminocido activado y protegido en el grupo amino

NH2 Z

NH 2Z

Sntesis de Pptidos
Introduccin, dificultades y secuencia Introduccin y dificultades Bloqueo del grupo amino Bloqueo del grupo carboxilo Activadores del grupo carboxilo Sntesis en fase slida

Sntesis de Pptidos
Cloruro de p-toluenosulfonilo
O CH 3 S Cl O

Bloqueo del grupo amino Eliminarlo Tosilo Ts Na en NH3

COOH
O R CH3 S O

C NH H

Cloruro de trifenilmetilo

Tritilo

Tt
R

H2 (Pd)
COOH C NH H

Cl

Sntesis de Pptidos
Cloruro de p-toluenosulfonilo Cloruro de trifenilmetilo Cloroformiato de terbutilo
CH3 CH3 C O C CH3 O Cl

Bloqueo del grupo amino Eliminarlo Tosilo Ts Na en NH3 Tt H2 (Pd) H2 (Pd)

COOH
CH 3 CH3 C O C CH 3 O

Tritilo

Butiloxicarbonil boc

C NH H

Monoazida del carbamato de terbutilo

CH3 CH3 C O C N N N CH3 O

Butiloxicarbonil boc
CH 3 CH3 C O C CH 3 O

H2 (Pd)
COOH R C NH H

Sntesis de Pptidos
Cloruro de p-toluenosulfonilo Cloruro de trifenilmetilo Cloroformiato de terbutilo Monoazida del carbamato de terbutilo Cloroformiato de bencilo
CH 2 O C O Cl

Bloqueo del grupo amino Eliminarlo Tosilo Ts Na en NH3 Tt H2 (Pd) H2 (Pd) H2 (Pd) cbz H2 (Pd)
COOH
CH2 O C O

Tritilo

Butiloxicarbonil boc Butiloxicarbonil boc Carbobenzoxi

C NH H

Sntesis de Pptidos
Cloruro de p-toluenosulfonilo Cloruro de trifenilmetilo Cloroformiato de terbutilo Monoazida del carbamato de terbutilo Cloroformiato de bencilo Cloruro de trifluoracetilo

Bloqueo del grupo amino Eliminarlo Tosilo Ts Na en NH3 Tt H2 (Pd) H2 (Pd) H2 (Pd) cbz tfa H2 (Pd) Bases dbiles
COOH C NH H

Tritilo

Butiloxicarbonil boc Butiloxicarbonil boc Carbobenzoxi Trifluoracetil

CF3

C Cl O
CF3 C O

Sntesis de Pptidos
Introduccin, dificultades y secuencia Introduccin y dificultades Bloqueo del grupo amino Bloqueo del grupo carboxilo Activadores del grupo carboxilo Sntesis en fase slida

Sntesis de Pptidos
Metanol etanol
CH 3 O H

Bloqueo del grupo carboxilo Eliminarlo Esteres

CH3

Bases dbiles
O
O C H C R NH2

Alcohol benclico
CH2 O H

Esteres

Bases dbiles
CH2 O
O C H C R NH2

terbutanol
CH 3 CH3 C O H CH 3

Esteres
CH3 CH3 C O CH3

H2 (Pd)
O C H C R NH2

Sntesis de Pptidos
Introduccin, dificultades y secuencia Introduccin y dificultades Bloqueo del grupo amino Bloqueo del grupo carboxilo Activadores del grupo carboxilo Sntesis en fase slida

Sntesis de Pptidos
Cloroformiato de isobutilo
O CH3 CH2 CH O C CH3 Cl

Activadores del grupo carboxilo BOC

O
O C H C R NH Bloq

CH 3 CH2 CH O C O CH 3

Diciclohexilcarbodiimida
N

DCCI

N C N
NH

C O

O C

H C R NH Bloq

Sntesis de Pptidos
Protecting group Methyl Formyl Ethyl Acetyl t-Butyl Anisyl Benzyl Mass Change 14.027 (Me) 28.104 (CHO) 28.054 (Et) 42.037 (Ac) 56.108 (t-Bu) 90.126

Otros grupos protectores

120.151 (Bom) 121.095 (ONp) 134.134 (Z) 149.106 (NBz) 153.161 (Nps) 154.189

Benzyloxymethy 4-Nitrophenyl Benzyloxycarbonyl 2-Nitrobenzoyl 2-Nitrophenylsulphenyl 4-Toluenesulphonyl (Tosyl,Tos)

Pentafluorophenyl 166.050 (Pfp) 90.126 (Bzl) Trifluroacetyl 96.009 (Tfa) Diphenylmethyl (Dpm) 166.222 (Dpm) N-hydroxysuccinimide 97.073 (ONSu OSu), 2-Chlorobenzyloxycarbonyl 168.579 (Cl-Z) t-Butyloxycarbony 100.117 (Boc) 2,4,5-trichlorophenyl 179.432 104.108 (Bz) Benzoyl 2-bromobenzyloxycarbonyl 213.031 (Br-Z) 104.152 (Meb) 4-Methylbenzyl Thioanizyl Thiocresyl 106.191 106.191 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl 222.243(Fmoc) Tripheylmethyl 242.320 (Trityl, Trt) 2,2,5,7,8-pentamethyl-chroman-6-sulphonyl

Sntesis de Pptidos
Introduccin, dificultades y secuencia Introduccin y dificultades Bloqueo del grupo amino Bloqueo del grupo carboxilo Activadores del grupo carboxilo Sntesis en fase slida

Sntesis de Merrifield
FASE SLIDA INSOLUBLE

FASE LIQUIDA

Cl4Sn
Cl CH2 O Et

Clorometilacin electroflica

Poliestireno

Preparacin del soporte

Sntesis de Merrifield
FASE SLIDA INSOLUBLE

FASE LIQUIDA

Cl4Sn
Cl CH2 O Et

Clorometilacin electroflica

Poliestireno

Preparacin del soporte

Sntesis de Merrifield
FASE SLIDA INSOLUBLE

FASE LIQUIDA

Cl

Cl

CH 2

O R

O C CH NH CO O

Poliestireno funcionalizado 1 al 10 %

Anclaje de un aminocido protegido

Sntesis de Merrifield
FASE SLIDA INSOLUBLE

FASE LIQUIDA

CF3 COOH
O R O C CH NH CO O CH 2

CH2Cl2

Primer aminocido anclado

Desproteccin del grupo amino

Sntesis de Merrifield
FASE SLIDA INSOLUBLE

FASE LIQUIDA

Cl

O C CH NH CO O

O R

O C

CH 2

CH NH 2

Primer aminocido anclado

Anclaje del segundo aminocido protegido

Sntesis de Merrifield
FASE SLIDA INSOLUBLE

FASE LIQUIDA

CH 2Cl2

CF3 COOH
O R O C CH NH R C CH NH CO O CH 2 O

Segundo aminocido anclado

Desproteccin del grupo amino

Sntesis de Merrifield
FASE SLIDA INSOLUBLE

FASE LIQUIDA

HF
O R O C CH NH R C CH NH 2 CH 2 O

Segundo aminocido anclado

Desanclaje del pptido del polmero

Sntesis de Merrifield
FASE SLIDA INSOLUBLE

FASE LIQUIDA

O
F CH 2

OH C O

OH C O

R CH NH C R

CH NH 2

R CH NH C R

CH NH 2

Pptido obtenido

Liberacin del pptido

Cl CH2 O Et

O R

O C CH NH CO O

Cl4Sn

Sntesis de Merrifield

Cl

CH2

CH2Cl2
CF3 COOH

O C

CH2

O R O O C CH2 O

O C CH NH CO O O O C CH2

R CH NH CO O

R CH NH2

R CH NH C R

CH NH2 CO O

HF
Cl
F CH2

Aminocidos y Pptidos
Ha finalizado la exposicin Muchas gracias por su atencin

Pedro Antonio Garca Ruiz

Catedrtico de Escuela Universitaria Area Qumica analtica Profesor Titular de Universidad Area Qumica Orgnica

Departamento de Qumica Orgsnica - Universidad de Murcia

Aminocidos y Pptidos
Aminocidos Anlisis de Pptidos Sntesis de Pptidos