Biotecnologia

Optimizao da expresso do interfero humano recombinante IFN- 2b em Escherichia coli

Tpicos
Interferes E. coli Codon bias /Bottlenecks Metodologia Resultados Concluses

Interferes
Tipo I Produzidos por macrofagos, neutrfilos em resposta a uma infeco (viral ou bacteriana) Tipo II Esto envolvidos no controlo das funes do sistema imunitrio

E. coli
Hospedeiro ideal Caractersticas singulares a nvel estrutural Condes usage (eucariota/procariota) Transcrio de genes de protenas de elevada expresso

Codons bias / Bottlenecks

Difcil expresso de genes eucariotas em E.coli Pouca quantidade de tRNA Competio entre clusters na sequncia SD Sequncia Consenso
AGGAGGU

E.coli

Codo AGG

Metodologia
Construo de 6 oligmeros
1. 50-TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAT AGC CTG GGC AGC CGT CGT ACC CTG ATG CTG CTG GCG CAG ATG CGT CGT ATC AGC CTG TTT AGC TGC CTG AAA GAT CGT-30 2. 50-CTG GAT CAT TTC ATG CAG AAC CGG GAT GGT TTC CGC TTT CTG AAA CTG GTT GCC AAA TTC TTC CTG CGG AAA GCC AAA ATC ATG ACG ATC TTT CAG GCA GCT-30 3. 50-GTT CTG CAT GAA ATG ATC CAG CAG ATC TTT AAC CTG TTT AGC ACC AAA GAT AGC AGC GCG GCG TGG GAT GAA ACC CTG CTG GAT AAA TTT TAT ACC GAA-30 4. 50-ATC TTC TTT CAT CAG CGG GGT TTC GGT AAC GCC AAC GCC CTG GAT AAC GCA CGC TTC CAG ATC GTT CAG CTG CTG ATA CAG TTC GGT ATA AAA TTT ATC CAG-30 5. 50-CCG CTG ATG AAA GAA GAT AGC ATC CTG GCG GTT CGT AAA TAT TTT CAG CGT ATC ACC CTG TAT CTG AAA GAA AAA AAA TAT AGC CCG TGC GCG TGG GAA-30 6. 50-GGA TCC TCA CTT ACT ACG CAG GCT TTC CTG CAG GTT GGT GCT CAG GCT AAA GCT ACG CAT GAT TTC CGC ACG AAC AAC TTC CCA CGC GCA CGG GCT-30

Vector pRSETA (NdeI e BamHI)

Metodologia
2 plasmdeos

pGP1-2 (T7 RNA polimerase)

pRSET-IFN- (Gene do interfero)

Metodologia
Expresso de rhIFN- 2b Em Frascos de Agitao (Esta cultura foi utilizada para
inocular 4 frascos diferentes com o mesmo meio e antibiticos para determinar o tempo ptimo de choque por aquecimento )

Em Biorreactores (fermentao ocorreu num

fermentador de 2L com um volume preenchido de 1L, com controlo de pH, temperatura, e oxignio dissolvido )

Metodologia
Medies da densidade das clulas Colheita, purificao, renaturao e nova purificao Western blot e ELISA Ensaio Biolgico

Resultados
Construo do plasmdeo pRSET-IFNFragmento amplificado foi duplamente digerido e de seguida incorporado. Incorporao nas clulas de E.coli. Expresso da protena (ELISA) Sequenciao do clone (GeneBank)

Resultados
Frascos de Agitao Crescimento em meio LB Choque trmico, com intervalos de tempo, como tcnica de induo Ao nvel da produo, muito elevada, quando a cultura foi induzida a uma temperatura de 42 C por 5min. Nos biorreactores os resultados so idnticos

Resultados
Efeito no crescimento celular
O crescimento foi de 0.45h at as 4h. Das 4h s 5h foi lentamente diminuindo at parar por completo. Esforo metablico /sntese da protena

Efeito do meio na produo

As clulas foram cultivadas em trs diferentes tipos de meio: TB LB T9 Mediu-se a densidade ptica e o volume produzido pelas clulas nestes diferentes meios

Discusso
Substituio dos codes menos usados pela bactria por codes correspondentes. Aumento da transcrio utilizando um vector, plasmdeo, com um promotor T7 e T7 RNA polimerase. T7 um dos promotores mais fortes para a sobreexpresso das protenas recombinantes em E.coli. Necessidade de nutrientes, em especial fontes de nitrognio. Meios ricos. Elevadas taxas de crescimento especfico esto relacionadas com elevadas taxas de expresso Decrscimo na taxa de crescimento -> paragem de produo da protena Alto grau de purificao.

Bibliografia
Poonam Srivastava, Palash Bhattacharaya, Gaurav Pandey, K.J. Mukherjee, Overexpression and purification of recombinant human interferon alpha2b in Escherichia coli, Protein Expression and Purification 41 (2005) 313 322 http://www.web-books.com/MoBio/Free/Ch2G2.htm http://www.ff.up.pt/toxicologia/monografias/ano0708/g13_isotretinoi na/isotretinoina_ficheiros/page0004.htm http://en.mimi.hu/biology/codon_bias.html http://en.wikipedia.org/wiki/Codon_usage_bias http://www.acapi.com/en/uknow.php