VALIDACIN DE UN MTODO DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOSESPECTROMETRA DE FLUORESCENCIA PARA LA CUANTIFICACIN DE CUATRO QUINOLONAS EN MSCULOS DE POLLO Y CERDO, SIGUIENDO LAS DIRECTRICES

DE LA NORMA EUROPEA EC/657/2002

Integrantes: Daniela Bobadilla Alvaro Etcheverry Nicols Faras Mariana Montanares

INTRODUCCIN

Qu son las quinolonas?

Las quinolonas son un grupo de antibiticos estructuralmente similares ampliamente utilizados en la industria agropecuaria. Con el fin de proteger la salud humana, la Unin Europea ha establecido lmites para las concentraciones permitidas en carne procedente de cerdos y aves. Las cuatro quinolonas ms usadas son la enrofloxacina, la ciprofloxacina, el cido oxolnico y la flumequina.

O F

O OH

O F

O OH

N HN

N CH3

Ciprofloxacina

Flumequina

O F

O OH

CH3 O O O O cido oxolnico N OH

N H3C N Enrofloxacina

Lmites mximos residuales

Compuesto Unin Europea Pollo (mg/kg) Ciprofloxacina + Enrofloxacina cido oxolnico Flumequina 0.1 para la suma de las concentraciones de ambos compuestos. 0.1 0.4 Cerdo (mg/kg) La misma que para el pollo. 0.1 0.2 Japn Pollo (mg/kg) 0.05 para la suma de las concentraciones de ambos compuestos . 0.03 0.5 Cerdo (mg/kg) La misma que para el pollo. 0.02 0.5

MTODO EXPERIMENTAL

Preparacin de las muestras

4 g de homogeneizado al que se le agregaron 9 mL de cido tricloroactico al 5%. La mezcla se homogeneiz a fondo en un vrtex por 1 min. Luego, la muestra se coloc en un agitador orbital a 20C durante 10 min y se centrifug a 2325xG por 10 min a 4C.

Se aadi el estndar interno (cido nalidxico) y se diluyeron las muestras a 1 g con cido frmico al 4%

La muestra se evapor y el residuo se disolvi en 600 L de cido frmico al 4% y se filtr con un filtro de membrana.

Al sobrenadante obtenido se le repiti el proceso anterior. Luego se cargaron los sobrenadantes en una columna C-18 y se eluyeron con una mezcla de MeOH/NH3 (75:25).

Instrumentacin
Auto-inyector, con estabilizador trmico. Detector de fluorescencia y uno de UV-Vis de arreglo de diodos. Columna de trabajo: X-Terra RP-18, fabricante Waters (fase reversa, C-18). Pre-columna: RP-18, fabricante Waters. Fase mvil: una mezcla de un bffer de fosfato de sodio 0.05 M pH=3 (A) con acetonitrilo (B). Se utiliz una elusin en gradiente (82% A por 5 min, 67% A por 10 min, y finalmente 82% A por otros 3 min). Flujo: 1 mL/min. La longitud de onda de excitacin fue de 280 nm y la de emisin de 450 nm durante los primeros 9 min. Luego, la longitud de onda de excitacin fue de 310 nm y la de emisin de 360 nm entre los 9 y los 27 min.

Mtodo de validacin
Se llev a cabo de acuerdo a las directrices que establece la Norma Europea EC/657/2002. Esto implica que se debe realizar la extraccin, purificacin y cuantificacin en tres das diferentes. En cada uno de estos das se prepararon 26 muestras: 3 muestras en blanco, 5 muestras de calibracin, 6 muestras estndar (2 para baja concentracin, 2 para media y 2 para alta), 6 muestras control a la mitad del LMR y 6 muestras control al LMR. Los parmetros de validacin estudiados fueron: la linealidad de las curvas de calibracin en el rango apropiado en los diferentes das; la recuperacin de las muestras obtenidas; precisin y reproducibilidad en el laboratorio; y, los lmites de cuantificacin y de deteccin.

RESULTADOS

Curvas de calibracin
Las curvas de calibracin obtenidas en tres das separados para las cuatro quinolonas bajo estudio resultaron ser lineales en el rango entre 0.005-0.200 mg/kg, lo que incluye el LMR y LMR. En todos los casos, las pendientes y los interceptos para cada compuestos de cada muestra (pollo o cerdo), fueron esencialmente las mismas en los tres das y los coeficientes de determinacin fueron 0.989.

Tiempos de retencin de las quinolonas en solucin

Valores promedio (g/kg) y coeficientes de variacin de las muestras

Promedio (g/kg) (CV%) Analito Da Cerdo 1 Enrofloxacina 2 39.95 (5.7) 40.71 (1.8) LMR Pollo 44.42 (2.6) 44.10 (3.5) Cerdo 81.85 (7.3) 88.62 (2.2) LMR Pollo 87.34 (4.4) 88.96 (3.1)

3 1
Ciprofloxacina 2 3 1 c. Oxolnico 2 3 1 Flumequina 2 3

42.56 (4.4) 43.69 (5.5)

44.73 (1.1) 47.50 (4.5) 43.00 (9.1) 42.18 (5.6) 34.95 (14.4) 39.24 (4.1) 40.21 (2.1) 41.43 (4.5)

41.28 (7.5) 50.23 (3.3)

47.19 (4.2) 47.11 (3.8) 40.77 (3.8) 41.35 (3.5) 39.21 (8.4) 44.37 (2.3) 41.87 (3.8) 42.30 (6.1)

87.31 (3.4) 90.53 (6.2)

95.33 (2.5) 96.16 (2.6) 80.60 (8.9) 88.99 (3.3) 81.64 (5.7) 76.83 (11.4) 88.10 (2.0) 87.43 (6.8)

82.92 (4.2) 97.70 (3.4)

95.90 (3.3) 95.15 (5.0) 80.90 (4.3) 81.51 (4.4) 81.72 (2.6) 91.74 (4.1) 82.81 (4.7) 87.56 (4.5)

Lmites de deteccin y lmites de cuantificacin para las cuatro quinolonas en el detector de fluorescencia
Analito Cerdo LD (g/kg) 1.3 1.1 LC (g/kg) 4.3 3.8 Pollo LD (g/kg) 1.2 2.7 LC (g/kg) 2.0 5.3

Enrofloxacina Ciprofloxacina

c. Oxolnico
Flumequina

4.1
2.4

13.5
8.0

13.0
13.2

18.4
17.0

CONCLUSIONES

 Es posible identificar y cuantificar simultneamente cuatro quinolonas presentes en los msculos de pollo y cerdo, mediante una metodologa utilizando HPLC y un detector de fluorescencia. El mtodo utilizado provee resultados satisfactorios en cuanto al rango de trabajo, recuperacin, precisin e incerteza. El mtodo es adecuado para anlisis de rutina en pruebas de campo, tomando en cuenta que puede ser llevado a cabo durante un da de trabajo. Para la ciprofloxacina y la enrofloxacina no se cumple la norma europea ni la norma japonesa. Para el cido oxolnico slo se cumple la norma europea. Mientras que para la flumequina se cumple tanto la norma europea como la norma japonesa.