Centrifugazione

Alle sospensioni viene applicato un campo gravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocit (Campo centrifugo). Viene sfruttata la differenza di densit tra le particelle ed il mezzo in cui sono sospese

Campo centrifugo
Il campo centrifugo (G) dato da: 2

G = r

Dove la velocit di rotazione espressa in radiantis-1 r la distanza dallasse di rotazione. Per esprimere la velocit di rotazione in girimin-1 (RPM):

2 RPM = 60

Il campo centrifugo viene quindi definito come:

4 2 ( RPM ) 2 G= r 3600

Campo centrifugo relativo

In genere il campo centrifugo viene espresso come campo centrifugo relativo (RCF) come multiplo della costante gravitazionale (980 cms-2):

G 4 ( RPM ) RCF = = r g 3600 980

2 2
Che diventa:

RCF = 1.1110 ( RPM ) r

2

Velocit di sedimentazione
F0 = v 6a
4 F = a3 ( p m ) 2r 3
Per F = F0 il moto rettilineo uniforme

4 3 2 v 6 a = a ( p m ) r 3

Velocit di sedimentazione
Velocit di sedimentazione della particella Raggio della particella Densit della particella Densit del mezzo

2 a ( p m ) 2 = r 9
2
Campo gravitazionale Costante per una sfera Viscosit del mezzo

Velocit di sedimentazione
Se una particella ha una densit uguale a quella del mezzo:

p = m =0

p m = 0

non vi sedimentazione.

Tempo di sedimentazione
Il tempo di sedimentazione si ottiene attraverso lintegrazione della legge di Stokes tra due raggi: r1 = raggio di rotazione alla superficie e r2 = raggio di rotazione al fondo

rb 9 t= 2 2 ln 2 a ( p m ) rt

rt rb

Coefficiente di sedimentazione
2 a ( p m ) 2 = r 9
2

Coefficiente di sedimentazione

1 S (Svedberg) = 10-13

Il principio della centrifugazione

Campo gravitazionale indotto con la centrifugazione
Sopranatante

Precipitato (pellet) Sospensione Separazione completata

Centrifughe

Centrifuga da banco

Ultracentrifuga

Centrifughe
RPM Da banco Micro Super Ultra 4000-6000 max. 16000 ~ 25000 ~ 80000 g 3000-7000 max. 22000 ~ 60000 ~ 600000

Centrifuga analitica

Centrifuga analitica

Centrifuga analitica (Profilo Schlieren)

Centrifugazione differenziale
A
Campo centrifugo

Z
Solvente Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi

Tempo di centrifugazione

Allinizio le particelle sono distribuite uniformemente nel mezzo (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni e della loro densit.

Centrifugazione zonale
A
Campo centrifugo
Campione

Gradiente di densit

Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi

Allinizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densit e della densit del mezzo.

Centrifugazione zonale
(caricamento ed eluizione in moto)
A. Il rotore, in moto a bassa velocit, viene caricato con il gradiente dalla periferia. B. Il gradiente formato C. Viene caricato il campione dal centro. D. Il rotore viene portato in velocit e avviene la sedimentazione. E. Il rotore viene rallentato e le bande vengono eluite usando un solvente pi denso.

Centrifugazione zonale
(con centrifuga apposita)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Il gradiente caricato nel rotore. il rotore accelerato lentamente, il gradiente si riorienta Il campione pompato ad una estremit del rotare Il campione sedimenta radialmente Alla fine il rotore decelera lentamente, Il gradiente si riorienta senza disturbare le bande di particelle Le bande vengono estratte usando una pompa peristaltica.

Centrifugazione isopicnica
A
Campo centrifugo

Z
Particelle piccole

Particelle medie che si vogliono separare Particelle grandi

Allinizio le particelle sono disperse nel mezzo (A) che ha densit uguale a quella delle particelle che si vogliono separare, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densit del mezzo uguale alla loro.

Centrifugazione isopicnica con gradiente

A Z
Campo centrifugo

Particelle piccole Particelle medie

Particelle grandi

Allinizio le particelle sono disperse nel mezzo (A), durante la centrifugazione si forma il gradiente, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densit del gradiente uguale alla loro.

Gradiente su rotore swing-out

Rotori
I rotori ad angolo fisso hanno piccole differenze tra rmax e rmin Il tempo richiesto per la sedimentazione minore per rotori ad angolo fisso I rotori ad angolo fisso sono pi pesanti e necessitano di una maggiore energia per operare I rotori a bracci mobili (Swing out) sono da preferire per centrifugare cellule e particelle Per sedimentare macromolecole e particelle fini si usano rotori ad angolo fisso I rotori a brazzi mobili sono da preferire per la centrifugazione su gradiente.

Rotore ad angolo fisso

rmax - rmin Rotore swing-out

rmax - rmin

Rotori

Rotore swing-out

Rotore ad angolo Fisso

Rotore zonale