UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA E INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

LAMBAYEQUE JUNIO DE 2012

INTRODUCCION
La clula, la unidad estructural bsica de la vida. La sobrevivencia del organismo completo depende de la coordinacin del metabolismo de millones de clulas, las cuales individualmente llevan a cabo funciones especficas: Nutricin Relacin intercelular Reproduccin

 Esta ltima funcin se caracteriza por poseer memoria.

Estas similitudes fundamentales entre los diferentes tipos de clulas proporcionan un marco comn para la biologa celular, permitiendo que los principios bsicos puedan ser extrapolados y generalizados a otros tipos de clulas. Es por ello que diversos tipos de clulas y organismos son extensamente utilizados en cultivos celulares debido a su fcil crecimiento y manipulacin experimental.

Cultivo de clulasespecfico animales Es el aislamiento de un tipo

de clulas provenientes de tejidos u rganos animales, que posteriormente son colocadas en un ambiente artificial que favorece su divisin, crecimiento, multiplicacin y en algunos casos, diferenciacin.
f

 el uso de cultivos celulares animales dentro de la

biotecnologa farmacutica se ha incrementado en los ltimos aos, ya que stos permiten la produccin de manera casi exclusiva de biolgicos y biofrmacos complejos (tales como vacunas tradicionales y recombinantes, protenas recombinantes glicosiladas, anticuerpos monoclonales, vectores virales para terapia gnica, etc.)

CLASIFICACIN DEL CULTIVO CELULAR

Los cultivos en monocapa

las

clulas que se desarrollan de esta manera son estables genticamente y tienen una naturaleza diploide normal. La monocapa celular crece (confluencia) cubriendo la superficie de soporte hasta que se establece contacto entre las clulas, lo que causa que stas detengan su crecimiento (quiescencia).

crecimiento en suspensin
se presenta en clulas

cuya naturaleza es de ese tipo como en el caso de clulas hematopoyticas o en aqullas que han perdido o disminuido la sntesis de protenas de anclaje y no desarrollan el proceso de quiascencia.

cultivos tridimensionales
se

busca mantener la arquitectura in vivo del tejido de origen. En el caso del epitelio, los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferacin, morfologa e interacciones intra e inter celulares. De igual forma se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden afectar tales interacciones. En este tipo de cultivo es posible mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena rplica del tejido de origen, sin embargo, la propagacin celular es dependiente de las caractersticas de la biomatrz o soporte.

Cultivo Primario y subcultivo

Cuando el cultivo proviene Estas clulas son

de clulas que han sido disgregadas de un tejido original tomado de algn rgano de un animal reciben el nombre de Cultivo Primario. Es decir, representa el cultivo de clulas de un fragmento de tejido obtenido a partir de un organismo

consideradas como cultivo primario hasta que se subcultiven con xito (es decir, sean transferidas, con o sin dilucin, de un recipiente de cultivo a otro). Los cultivos primarios se caracterizan por estar constituidos por diferentes tipos de clulas (por lo que a veces pueden recibir el nombre de cocultivos)

cultivo secundario
se establece cuando se hace el subcultivo exitoso a

partir de un cultivo primario. Las clulas dependientes de anclaje forman una monocapa que puede llegar a cubrir el soporte en el que crecen, el grado de cobertura del soporte se llama grado de confluencia.

Diferentes cultivos celulares de acuerdo a su

origen y modificacin gentica y fenotpica.

Conclusin de: Cultivo Celular

Un cultivo celular es aquel cultivo de clulas que tiene

alta capacidad de multiplicarse in vitro, el cual es establecido a partir del primer subcultivo de un cultivo primario y que tiene las mismas caractersticas que el tejido de origen. Su principal caracterstica es que tiene un nmero limitado de posibles subcultivos, cuyo nmero generalmente se encuentra entre 60 y 70 pases.

Lnea celular BHK 21 CHO HeLa IMR-90 L McCoy MDCK MRC-5

Origen Rion de cria Hamster sirio Ovario de hmster Chino Carcinoma cervical Humano Pulmn de embrin Humano Tejido conectivo de ratn Origen de ratn similar a las clulas L Rin canino Pulmn de embrin Humano

Caracterstica Fibroplasto dependiente del anclaje, pero puede inducirse en suspensin. Clulas en suspensin semejantes a las epiteliales Clulas en suspensin semejantes a las epiteliales Fibroblasto diploide con lapso de vida limitado Fibroblastos, clulas en suspensin Fibroblastos dependientes de anclaje Semejantes a las epiteliales, dependientes de anclaje Fibroblastos diploides, vida limitada Clulas en suspensin semejante a los linfoblastos Clulas en suspensin semejantes a los linfoblastos Fibroplastos dependientes del anclaje Fibroplastos diploides, vida limitada Fibroplastos dependientes de anclaje.

MPC-11 Mieloma de ratn Namal wa 3T3 .WI-38 Vero Linfoblastoide humano Tejifo conectivo del raton Pulmon de embrin humano Mono verde africano

El cultivo celular y sus productos

Una de las aplicaciones ms interesantes del cultivo

celular ha consistido en la obtencin de productos de uso teraputico que ya han alcanzado el mercado farmacutico. Los avances logrados en la tecnologa de cultivo celular han permitido que productos cada vez ms complejos se pongan al alcance del pblico usuario como por ejemplo ANTICUERPOS.

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
Los anticuerpos son molculas proteicas compuestas de cuatro cadenas, dos ligeras y dos pesadas unidas por puentes disulfuro, los cuales tienen diversas funciones tales como reconocimiento y neutralizacin de antgenos, presentacin de antgenos a clulas efectoras y activacin del sistema de complemento. Desde el punto de vista funcional, los anticuerpos presentan una fraccin que reconoce al antgeno y otra fraccin cristalizable que meda funciones efectoras como la respuesta citotxica dependiente del anticuerpo y aquella que depende del complemento.

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
La fraccin que reconoce al antgeno tiene una regin variable y una regin constante. La primera de estas dos es muy diversa en virtud de la variedad de antgenos. La segunda permite la estabilizacin de la fraccin variable. Los anticuerpos son producidos por clulas B del sistema inmune y responden a un solo determinante antignico.

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
Los anticuerpos son herramientas muy importantes de la investigacin cientfica al poderse localizar, identificar y cuantificar niveles de expresin de productos gnicos, se han usado tambin en la caracterizacin y tipificacin de clulas particulares; mediante su uso, se pueden tambin conocer interacciones moleculares y celulares. En la prctica clnica, los anticuerpos son tiles en diagnstico y tratamiento de padecimientos.

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
La produccin de anticuerpos monoclonales (provenientes de una sola clona de linfocitos B) surgi con la tecnologa creada por Milstein y Khler en 197518 que permiti la fusin de linfocitos B, productores de inmunoglobulinas especficas, con clulas de mieloma tumoral que se encuentran permanentemente en crecimiento.

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
Con esta fusin se obtienen los hibridomas que crecen de manera casi ilimitada produciendo anticuerpos especficos contra un antgeno particular. Con el advenimiento de las tcnicas de biologa molecular la produccin de hibridomas ha llegado ms lejos y se han logrado reducir las respuestas de rechazo que se producen cuando los anticuerpos son producidos en ratn.

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
Con el objeto de reducir el rechazo, se incluyen secuencias humanas en los anticuerpos, en un proceso que se ha llamado quimerizacin, a pesar del cual el 40% de los anticuerpos quimricos producen cierto tipo de rechazo29. El siguiente paso tecnolgico ha consistido en la humanizacin de los anticuerpos, una etapa importante en este proceso fue el establecimiento en Cambridge de una lnea de hibridoma totalmente humana.

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
La mayora de los anticuerpos comercializados son producidos por dos vas, usando tecnologa de ADN recombinante en clulas de mamfero (como las CHO) o clulas linfoides murinas (como NSO, Sp2/0-Ag14), o bien en hibridomas.

BIORREACTORES
Una gran variedad de sistemas in vitro se utilizan para crecer hibridomas, incluyendo placas multipocillo, placas Petri, matraces T, contenedores multidisco, cartuchos de fibra hueca, botellas de rodillos, matraces de agitacin, frascos spinner, fermentadores de transporte areo, y fermentadores de tanque agitado (30 - 44). Los biorreactores proporcionan el recipiente y el entorno fsico-qumico, que incluye, entre los factores ms importantes, pH, temperatura, agitacin, el intercambio de gases, el potencial redox, y la osmolaridad.

PRODUCCION DE ANTICUERPOS
Produccin de anticuerpos policlonales

Proceso relativamente sencillo, se inmuniza el animal y el sistema inmunolgico de este responde al antgeno para producir anticuerpos contra la molcula inyectada. Desventajas: - Los resultados no son predecibles. - Los animales individualmente e incluso de la misma identidad gentica, responden de manera diferente generando anticuerpos diferentes contra la molcula inyectada.

EL SISTEMA INMUNE
Es un sistema de vigilancia diseado para

proveer proteccin al inquilino de invasores externos.

La proteccin inmune es proveda por un

sistema dual compuesto por la respuesta celular inmune y por la respuesta humoral inmune.

SISTEMA INMUNE
Producida RESPUESTA por Linfocitos INMUNE T
Envuelve proteinas solubles encontradas en el suero (anticuerpos)

INMUNIDAD HUMORAL

INMUNOGENICIDAD
ANTGENOS E INMUNGENOS

Antgeno: Es cualquier molcula identificada como no propia por los componentes del sistema inmune. Inmungeno: Es un antgeno que es capaz de provocar una respuesta inmune incluyendo la produccin de anticuerpos va respuesta inmune. TODOS LOS INMUNGENOS SON ANTGENOS PERO NO TODOS LOS ANTGENOS SON INMUNGENOS.

INMUNOGENICIDAD
Propiedades que determinan la inmunogenicidad

- Externa: Para que el sistema no la reconozca como propia y la ignore. Generalmente los compuestos de un organismo no son inmunognicos al mismo individuo y son inmunognicamente pobres para individuos de la misma especie. - Peso Molecular: compuestos de tamao pequeo. La mayora de los compuestos con MW> 6.000 son inmunognicos. - Complejidad Qumica

INMUNOGENICIDAD
Macromolculas como inmungenos

- Los carbohidratos son solo inmunognicos si tienen una estructura relativamente compleja de polisacridos o forman parte de una molcula ms compleja, como glicoprotenas. - Los lpidos normalmente no son inmunognicos pero pueden hacerse si se conjugan a una protena crrier. Lo mismo les pasa a los cidos nuclicos. - Las protenas son generalmente buenas inmungenas.

INMUNOGENICIDAD
Haptenos y eptopos

- Pptidos otras molculas pequeas que se usan como antgenos les llamamos haptenos. Son antignicos, no inmunognicos. Los haptenos pueden hacerse inmunognicos unindolos a un carrier.

- Un eptopo es el sitio especfico del antgeno donde se une el anticuerpo. Para antgenos muy pequeos, prcticamente la estructura completa puede actuar como eptopo.

CARRIERS
Es cualquier protena usada para unirse

con pptidos u otros haptenos que no son suficientemente grandes o complejo por s mismos para inducir una respuesta inmune para producir anticuerpos. Confiere inmunogenicidad al hapteno conjugado, resultando la produccin de anticuerpos de eptopos del hapteno y el carrier.

CARRIERS
KLH como carrier

- KLH es ampliamente usado como carrier por su gran peso molecular (agregados de 450.000-8.000.000 kDa compuestos de subunidades de 350 y 390 kDa) y muchos grupos lisina disponibles. - Es una protena que contiene cobre que pertenece a un grupo de protenas llamadas hemocianinas que se encuentran en artrpodos y moluscos. - KLH se asla del molusco Megathura Crenulata.

 BSA y OVA como carriers

- La albmina srica bovina (BSA; peso molecular 67.000) pertenece a la clase de protenas sricas llamadas albminas. Las albminas constituyen ms o menos la mitad del contenido de protenas del plasma y son bastante estables y solubles.

- BSA es mucho ms pequea que el KLH pero es completamente inmunognica. - Es un carrier bastante popular para compuestos poco antignicos.

PURIFICACION DE ANTICUERPOS Los anticuerpos son protenas, es por eso que los mtodos de purificacin a partir de muestras biolgicas (suero, fluido asctico o sobrenadante de cultivo) son formas especializadas de los mtodos de purificacin de protenas. La purificacin se puede hacer: En forma cruda, es decir precipitando todas las inmunoglobulinas y otras protenas. Solo los anticuerpos que puedan fijarse a un antgeno especfico.

La purificacin cruda de anticuerpos se puede hacer con diferentes mtodos como: Precipitacin con per-sulfato de amonio Adsorcin tioflica Cromatografa de intercambio inico.

Estos mtodos son tiles dependiendo de la aplicacin en la que vayamos a utilizar nuestro anticuerpo. En aplicaciones a mayor escala normalmente se utiliza el intercambio inico para purificar un tipo de inmunoglobulina, en cambio en investigacin y en produccin a pequea escala se utiliza ms la purificacin por afinidad.

La cromatografa por afinidad (purificacin por afinidad), un ligando es unido a un soporte slido, como por ejemplo crosslinkado a gel de bolas de agarosa. La muestra fluida pasa a travs del soporte material permitiendo que las inmunoglobulinas se unan al ligando inmovilizado. Mientras que los componentes que no se han unido se lavan y eluyen del soporte. Posteriormente ponemos un buffer que nos cambie las condiciones del medio y haga que se rompa la unin entre la inmunoglobulina y el ligando de manera que podamos eluir nuestro anticuerpo en una forma purificada. Proteina A, protena G y sus formas recombinantes, son componentes de la pared celular bacteriana que se unen a la regin Fc de las inmunoglobulinas y son de lejos las ms escogidas para purificar IgG por afinidad. La protena L es la tercera protena de origen bacteriano que ha sido desarrollada para usarla en purificacin anticuerpos por afinidad, se une a diferentes clases de inmunoglobulinas (por ejemplo IgG, IgM, IgA) siempre y cuando tengan la cadena ligera Kappa. Algunas lectinas se unen especficamente a IgA humana. Mannan binding protein (MBP) nos permite purificar IgM tanto humana como de ratn.

Como en cualquier mtodo de purificacin, los buffers de unin como de elusin son componentes importantes en la purificacin de anticuerpos cuando se usan los ligandos comentados anteriormente. Generalmente, la fuerza inica y el pH son los factores ms importantes afectando la eficiencia de unin y consecuentemente la elusin de las inmunoglobulinas de estos ligandos. Sin embargo, la temperatura y otros componentes son tambin importantes en casos particulares.

Para purificar anticuerpos especficos contra antgenos, hemos de inmovilizar el antgeno a un soporte y lo utilizamos para purificar por afinidad las inmunoglobulinas que se unan a l.

LOS METODOS DE PURIFICACION La eleccin de un mtodo de purificacin se basa en factores diferentes: El anticuerpo La materia prima La economa La pureza deseada El proceso de purificacin se puede dividir en cuatro partes. La figura 1 presenta un diagrama de flujo de estos pasos, junto con las tcnicas ms comunes que se utilizan para cada paso.

Diagrama de flujo general para la purificacin de anticuerpos, que muestra (a la izquierda) tcnicas normalmente utilizadas en cada paso.

El propsito de la primera parte, la preparacin de muestras, es asegurar la disposicin de la muestra para la primera etapa de purificacin. Preparacin de la muestra a veces no es necesaria, dependiendo de la naturaleza del material de alimentacin crudo y de la eleccin de la primera etapa de purificacin. Preparacin de la muestra es seguida por la primera etapa de purificacin, a menudo conocida como captura de producto inicial. Ms tpicamente, la metodologa para este paso se elige para dar un factor de purificacin de alto. De hecho, para productos de anticuerpos con requisitos menos estrictos de purificacin (por ejemplo, para uso in vitro), esto puede ser la etapa de purificacin slo se requiere, si adecuadamente elegido. La tercera parte del procedimiento es cualquier etapa de purificacin adicional necesario para alcanzar la pureza requerida. Estos pasos se denominan a veces como pasos de pulido. La parte final del procedimiento consiste en poner el producto en la formulacin final, es decir, la concentracin final deseada y el estado fsico. Esto a veces puede lograrse por la etapa de purificacin final en s, eliminando la necesidad de separar los pasos adicionales.